Summary
Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.
Abstract
De snelheid van translationeel rek is niet uniform. mRNA secundaire structuur, codongebruik en mRNA bijbehorende eiwitten kunnen ribosoom beweging te wijzigen op het bericht voor review zie 1. Echter, het is nu algemeen aanvaard dat synoniem codon-gebruik is de belangrijkste oorzaak van niet-uniforme translationeel rek tarieven 1. Synoniem codons worden niet gebruikt met dezelfde frequentie. Een voorkeur bestaat in het gebruik van synoniem codons enkele codons vaker gebruikt dan andere twee. Codon bias is organisme en weefsel-specifieke 2,3. Bovendien frequentie codongebruik is recht evenredig met de concentratie van verwante tRNA 4. Zo zal een veel gebruikte codon hogere massa overeenkomstige tRNA, die verder betekent dat vaak codon harder dan een zeldzame een vertaald. Zo zal de regio's op mRNA verrijkt met zeldzame codons (potentiële pauze sites) te vertragen in de regel naar beneden ribosoom beweging op de Message en de oorzaak accumulatie van ontluikende peptiden van de respectievelijke maten 5-8. Deze pauze sites kunnen functionele impact hebben op de eiwitexpressie hebben, mRNA stabiliteit en het vouwen van eiwitten voor review zie 9. Er werd aangetoond dat het verlichten van deze pauze sites ribosoom beweging te wijzigen op mRNA en vervolgens kan de efficiëntie van co-translationele (in vivo) eiwitvouwing 1,7,10,11 beïnvloeden. Om het proces van eiwitvouwing in vivo begrijpen in de cel, die uiteindelijk is gekoppeld met de werkwijze van de eiwitsynthese is het noodzakelijk volledig inzicht in het effect van codongebruik / tRNA inhoud van de beweging van ribosomen langs mRNA tijdens translatie elongatie .
Beschrijven we een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om grote vertaling onderbreken plaatsen voor een bepaalde mRNA vertaald in verschillende celvrije systemen 6-8 vinden. Deze procedure is gebaseerd op de isolatie van ontluikende Polypeptiden accumulating van ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA. De reden is dat bij lage frequenties codons, de toename van de verblijftijd van de ribosomen resultaten in grotere hoeveelheden beginnende peptiden van de overeenkomstige afmetingen. In vitro getranscribeerde mRNA gebruikt voor in vitro translatie reacties in aanwezigheid van radioactief gemerkt aminozuren de detectie van de beginnende ketens mogelijk. Om ribosoom gebonden beginnende polypeptide complexen isoleren vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing gevolgd door centrifugatie. Nascent Polypeptiden in polysomal pellet verder behandeld wordt met ribonuclease A en opgelost door SDS-PAGE. Deze techniek kan eventueel worden gebruikt voor een eiwit en laat analyse van ribosoom beweging langs mRNA en de detectie van de grote pauze sites. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan factoren en omstandigheden die ribosoom beweging kan dus veranderen en mogelijk kan ook veranderen e bestuderene functie / conformatie van het eiwit.
Protocol
1. DNA Template Voorbereiding en in vitro transcriptie
- Het gen van belang wordt gekloneerd onder T7 en / of bijvoorbeeld SP6 transcriptionele promoter.
- Voor in vitro transcriptie het template-DNA wordt gelineariseerd met een geschikte restrictie-enzym snijden achter het stopcodon ORF en / of mRNA 3 'uiteinde. Men moet volledig linearisatie van het plasmide DNA te controleren door uitvoering van de restrictiedigestie product agarosegelelektroforese.
- De gelineariseerde plasmide wordt gebruikt voor in vitro transcriptie reactie. Verschillende concentraties van template DNA kan worden getest om optimale DNA vereiste concentratie in vitro transcriptie identificeren. Algemeen met MEGAscript hoog rendement Ambion de transcriptiekit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg lineair DNA geeft 40-60 ug mRNA. In vitro transcriptie plaats volgens instructies van de fabrikant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
- Naar aanleiding van in vitro transcriptie het mRNA wordt gezuiverd door middel van lithium chloride neerslag volgens de fabrikant instructie (MEGAscript High Ambion het rendement Transcription Kit).
- mRNA integriteit verder onderzocht door elektroforese op acrylamide of agarose gels.
2. In vitro Cell Vertaling
Voor de in vitro translatie met R abbit R eticulocyte Lysate, RRL (Promega, Madison, WI) Volg de onderstaande stappen:
- Bereid 100 pi in het instructieboek van vitro translatie reactie na de fabrikant. Kortom, toe te voegen in nuclease gratis water 2 pl aminozuurmengsel min methionine (1 mm), 10 eenheden van RNase-remmer (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi van radioactieve [35 S]-methionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 pi van konijn reticulocyten lysaat (Promega, Madison, WI).
- Incubeer ee reactie bij 30 ° C gedurende 5 min warm de vertaling reactie vooraf. Voeg 2 ug mRNA de vertaling reactie en incuberen bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
- Stop de reactie door plaatsen van de vertaling reactie op ijs.
3. Isolatie van Nascent Polypeptiden van in vitro translatie Reaction
- Op beginnende polypeptide gebonden aan ribosomen (polysoompeptiden) isoleren wordt vertaling reactie lagen op 4,5 ml 30% glycerol in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, bevattende 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2 en gecentrifugeerd bij 100.000 x g een TLA-110 rotor (Beekman Coulter, Inc Brea, CA) gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- De supernatant wordt verder zorgvuldig verwijderd.
- De polysomal pellet met nascent Polypeptiden wordt geresuspendeerd in een volume (10-15 ul) van 1 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, 0,5 mg / ml ribonuclease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) en geïncubeerd 30 min bij 37 ° C. Omde hydrolyse van de peptidyl-tRNA esterbinding vergroten wordt NaOH toegevoegd tot een eindconcentratie van 10 mM en de incubatie wordt gedurende nog eens 30 minuten.
In vitro translatie reactie gemonteerd zonder mRNA en bij dezelfde omstandigheden (gevolgd door isolatie van opkomende peptiden zoals beschreven) zou vormen een belangrijke controle. Behandeling van de vertaling reactie (s) vóór het onderwerpen van het puromycine extract dichtheid gradiënt centrifugatie kunnen dienen als extra controle.
4. Het oplossen van de ontluikende polypeptide op Tris-tricine SDS-PAGE
- De geïsoleerde ontluikende Polypeptiden worden opgelost en geanalyseerd op Tris-tricine SDS-PAGE. Let op: de hoeveelheid van het materiaal geladen op de gel zal afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten etikettering, de efficiëntie op eiwit vertaling en vele andere parameters. De hoeveelheid geladen materiaal moet empirisch worden aangepast aan de bes zodatt visualisatie en de scheiding van de individuele ontluikende polypeptide ketens.
- Na elektroforese gels zijn bevestigd, gedroogd onder vacuüm gel verver en aan autoradiografie. De verdeling van de ontluikende Polypeptiden worden waargenomen met behulp van phosphoimaging.
5. Representatieve resultaten
Bovine Gamma-B crystalline vertaald in Rabbit reticulocyten lysaat en in E. coli S30 Extract Systems (Promega, Madison, WI), gevolgd door isolatie van opkomende polypeptideketens. Figuur 1 toont stappen los van ribosoom gebonden beginnende ketens. In deze studie was het doel te testen als veranderende milieu van vertaling ie repertoire van tRNA (bekend onder zeer uiteenlopende in zoogdieren (RRL) en prokaryotische (E. coli) systemen gevolg zijn van verschillen in codon voorkeur tussen organismen) kan veranderen ribosoom beweging langs mRNA en hebben effect op de verdeling van de vertaling pauze sites.Gewijzigde ribosoom beweging moet leiden tot veranderingen in de verdeling van de grootte van opkomende Polypeptiden accumuleren in vertaling alsmede de relatieve intensiteit. Relatieve intensiteit van de banden door de duur van de pauze. De opkomende Polypeptiden werden geïsoleerd en opgelost in 16,5% T, 6% C Tris-tricine SDS PAGE (figuur 2). Gamma-B crystalline een 20 kDa eiwit. De waarneming van ontluikende Polypeptiden van niet-identieke lengte en intensiteit in RRL en E. coli systemen geeft aan dat de beweging van ribosomen langs mRNA in beide systemen verschillende vertaling kinetiek volgt. Zo zagen we een prominente band van 17,7 kDa in E. coli lysaat en niet RRL systeem, wat suggereert dat er een extra translatie pauze site in het 3'-uiteinde regio mRNA (codering C-terminale gebied van Gamma B crystalline), wanneer deze vertaling in E. coli systeem. Wij merken op dat Gamma-B crystalline havens tandem Arg codons (AGG 153 en AGA 154) die frequent in zoogdiersystemen, maar staan bekend als zeer zeldzaam langzaam vertaald in E. coli. Een nieuwe groeiend peptide dat zich in E. coli-systeem (~ 17,7 kDa figuur 2.2) wordt waarschijnlijk veroorzaakt door ribosoom te pauzeren op deze tandem zeldzame codons. Let geen banden worden waargenomen in de afwezigheid van mRNA (figuur 2.3) en puromycine behandeling verwijdert meeste opkomende kettingen polysomen (figuur 2.3). Langdurige behandeling met puromycine (> 15 min) verwijderen de ontluikende ketens (gegevens niet getoond). Dit bevestigt dat de waargenomen polypeptide producten zijn ribosoom bijbehorende ontluikende kettingen, in plaats van mRNPs cosedimenting met polysomen.
Zoals hierboven vermeld, codon bias organisme en weefselspecifiek. Het representatief voorbeeld hier beschreven, geeft duidelijk aan dat het veranderen van de omgeving van de vertaling wil zeggen repertoire van tRNA's / codonvertekening kan leiden tot een verandering beweging van ribosoom langs het mRNA. Uiteraard kunnen deze eenvoudige techniek niet alleen mogelijk de identificatie van de translationele pauze plaatsen langs mRNA, maar maakt ook snelle vergelijking van de vertaling pauze plaatsen tussen verschillende systemen.
Figuur 1. Schematische over de stappen die betrokken zijn bij het isoleren van ribosoom gebonden ontluikende Polypeptiden. Bovine Gamma-B crystalline ORF volgorde (528 baseparen) is stroomafwaarts van T7-promotor gekloneerd in pBSKS +. Voor in vitro transcriptie de template DNA werd gelineariseerd door behandeling met EcoRI. Lineair template werd gebruikt voor in vitro transcriptie. T7 promoter in DNA-template herkend door T7-RNA-polymerase dat stroomafwaarts Gamma-B crystalline gen overschrijft. mRNA wordt gezuiverd met lithiumchloride precipitatie. Het gezuiverde mRNA wordt gebruikt voor in vitro translatie. Volgendincubatie vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing en gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 4 ° C bij 100.000 x g om ribosoom gebonden opkomende Polypeptiden geïsoleerd.
Figuur 2. Isolatie van Bovine Gamma-B-crystalline ontluikende Polypeptiden vertaald in Rabbit reticulocytentelling Lysate (RRL) en E. coli lysaat. 2 ug mRNA werd gemengd met 100 pi reactiemengsel RRL of E. coli S30 Extract System (Promega, Madison, WI) volgens de instructies van instructies van 20 pCi [35S]-methionine en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 5 minuten. Na incubatie vertaling reactie lagen op 4,5 ml 30% glycerol in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, bevattende 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2 en gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 4 ° C en 100.000 x g in een TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). De geïsoleerde polyribosome pellet was resubesteedde in 20 pi 1 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,5 mg / ml ribonuclease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) gevolgd door behandeling met NaOH (zoals beschreven in het protocol sectie). Ontluikende polypeptiden werden opgelost op 16,5% T, 6% C Tris-Tricine SDS PAGE gel. De gel werd gedroogd en blootgesteld autoradiografie. Na blootstelling van de gel werd gescand met behulp van Typhoon Imaging GE Healthcare's Scanner. In figuur 2.1 is de gel met ontluikende Polypeptiden geïsoleerd en opgelost na vertaling reacties op twee verschillende systemen (RRL en E. coli). Figuur 2.2 De gel werd geanalyseerd door Image Quant TL ., v2005 software en hier gebruikt als voorbeeld om aan te tonen dat de moleculaire gewicht en de intensiteit van de ontluikende Polypeptiden zich ophopen in twee systemen kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd en vergeleken met Figuur 2.3 toont twee sets van de controles: ontluikende Polypeptiden geïsoleerd en opgelost op SDS-PAGE na vertaling reacties werden verzameldzonder mRNA en / of na de vertaling reacties werden behandeld met puromycine (5 min laatste conc. 1 mM) voor de reactie werd onderworpen aan centrifugeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie reacties kritisch zijn. In de huidige studie hebben we gebruik hebben gemaakt van commercieel verkrijgbare kits en extracten die zeer reproduceerbare gegevens te verstrekken, indien zorgvuldig behandeld. Echter, vertaling-competent extracten worden bereid uit de cel van een keuze, indien nodig. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de integriteit van mRNA's te testen alvorens het te gebruiken tijdens de in vitro vertaling.
Daarnaast kan de duur van de in vitro translatie-reactie worden geoptimaliseerd voor elk eiwit. Dit is een cruciale stap voor isolatie van ontluikende Polypeptiden. Uitgebreide incubatie leidt tot de synthese van de volledige-lengte proteïne en het vrijgeven van de meerderheid van beginnende Polypeptiden van de ribosomen. Incubatietijd kan worden geoptimaliseerd door het uitvoeren van in vitro translatie rEACTIES verschillende tijdstippen. Als aan de tijd benodigd voor vertaling van het volledige-lengte proteïne wordt vastgesteld, volgende stap is een reeks experimenten in deze tijd de incubatieperiode identificeren waar de meeste opkomende Polypeptiden nog steeds worden gebonden aan de ribosoom (s ) (dat wil zeggen de vertaling inleiden en het beëindigen processen zou nog steeds in evenwicht zijn). De vertaling reactie kan ook worden gestopt door toevoeging van antibiotica arrest translationele rek (bijv. cycloheximide). Het is duidelijk dat dit experimentele systeem zou resolutie en analyse van de belangrijkste pauze plaatsen langs mRNA en het oplossend vermogen van de gel systeem worden gebruikt zou een belangrijke invloed op de kwaliteit van de resultaten. Tricine-natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese zodat scheiding van eiwitten in het bereik van 1 tot 100 kDa wordt aanbevolen voor gebruik in dergelijke experimenten 12. Opgemerkt dat deze strategiekan ook worden aangepast om de analyse van de ligging van pauze plaatsen in eiwitexpressie in vivo (in cellen). In het laatste geval moet het totaal polysomal fractie bij het metabolisch gelabelde cellen eerst worden geïsoleerd. Polysomen vertaling specifieke mRNA van belang zou dan worden geïsoleerd door immunoprecipitatie met anti-(eiwit van interesse) antilichamen en analyse van de gelabelde opkomende kettingen worden beschreven. Het verdient de voorkeur om antilichamen tegen N-terminale gebied van het eiwit van belang te gebruiken. Indien nodig kan eiwit van interesse worden gelabeld met bv FLAG-peptide op een efficiënte pull-down. Een alternatieve protocol gebaseerd op selectieve isolatie vertalen ribosomen gebonden aan een biotine-gelabeld mRNA werd onlangs ook beschreven meetinrichting 13. Opgemerkt dat nauwkeuriger bepaling van de vertaling pauze sites, vooral bij grote eiwitten kan micrococcal nuclease bescherming assay 5 gebruiken. Een modificatie van thij later assay dat gebaseerd is op de diepe volgorde van ribosoom-beschermde mRNA fragmenten en maakt onderzoek eiwit translationele dynamica van het genoom-niveau, is ook beschreven 14.
De eenvoudige en zeer flexibele techniek beschreven in dit document kan worden gebruikt om beweging van ribosomen langs mRNA te volgen, helpen bij het identificeren vertaling pauze sites en ook testen factoren en omstandigheden die ribosoom beweging kan veranderen tijdens het translationele rek. Het kan eventueel worden gebruikt voor het optimaliseren van co-translationele eiwitvouwing in heterologe systeem (s) door aanpassing van de juiste plaatsen van de grootste vertaling pauze sites gebruik synoniem codon substituties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie RGP0024.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 | |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 | |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 | |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge | |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager | |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
