Summary
Influensavirus replikera sitt RNA-genom i association med värd-cell-kromatin. Här presenterar vi en metod för att rena intakta virala ribonukleoproteinpartiklar komplex från kromatin av infekterade celler. Renat virus komplex kan analyseras genom både Western blöt och primerförlängning av protein och RNA-halt, respektive.
Abstract
Liksom alla negativ-strängade RNA-virus, är i genomet hos influensavirus förpackas i form av virala ribonukleoproteinpartiklar komplex (vRNP), i vilka den enkelsträngade genomet är inkapslade av nukleoprotein (NP) och associerad med den trimera polymeras komplex bestående av PA, PB1, och PB2 subenheter. Emellertid, i motsats till de flesta RNA-virus, influensavirus utföra virala RNA-syntes i kärnan av infekterade celler. Intressant nog använder virala mRNA-syntes cellulära pre-mRNA som primers, och det har föreslagits att denna process äger rum på kromatin 1. Interaktioner mellan virala polymeraset och värd-RNA-polymeras II, såväl som mellan nonylfenol och nukleosomer värdceller har också karaktäriserats 1,2.
Nyligen framtagandet av rekombinanta influensavirus som kodar en En-strep-markör fuserad genetiskt till C-terminalen av den PB2-subenheten av det virala polymeraset (rWSN-PB2-Strep 3) har blisv beskrivits. Dessa rekombinanta virus tillåta reningen av PB2-innehållande komplex, inklusive vRNPs, från infekterade celler. För att erhålla renat vRNPs är cellkulturer infekterades, och vRNPs är affinitetsrenades från lysat härrörande från dessa celler. Har dock lys förfaranden som används hittills varit baserad på en steg tvättmedel lys, som trots närvaron av en allmän nukleas, ofta extrahera kromatin-bundna materialet enbart ineffektivt.
Våra preliminära arbete föreslog att en stor del av nukleära vRNPs inte extraherades under traditionella cellys, och kunde därför inte vara affinitetsrenade. För att öka denna extraktion effektivitet och för att separera kromatin-bundet från icke-kromatin-bundna kärnvapen vRNPs, anpassade vi en stegvis subcellulär utvinning protokoll till influensa virus-infekterade celler. Kortfattat separerar detta förfarande först kärnorna från cellen och därefter extraherar lösliga nukleära proteiner (här benämnd "nucleoplasmic" fraktion).Den återstående olösliga kärnmaterial digereras sedan med Benzonase, en ospecifik DNA / RNA-nukleas, följt av två steg saltextraktion: först med användning av 150 mM NaCl (benämnd "CH150"), sedan 500 mM NaCl ("ch500") (fig 1 ). Dessa salt extraktionssteg valdes baserat på vår iakttagelse att 500 mM NaCl var tillräcklig för att solubilisera över 85% av kärn-vRNPs ändå medge bindning av märkta vRNPs till affinitetsmatrisen.
Efter subcellulär fraktionering av infekterade celler, är det möjligt att affinitetsrena PB2-märkta vRNPs från varje individuell fraktion och analysera deras protein-och RNA-komponenter med Western blöt och primerförlängning, respektive. Nyligen utnyttjade vi denna metod för att upptäcka att vRNP export komplex form under slutet av poäng efter infektion på kromatinet fraktionen extraheras med 500 mM NaCl (ch500) 3.
Protocol
En schematisk flödesschema av det protokoll som visas i fig.. 1 och en tabell av reagens redovisas nedan.
1. Infektion (16 - 24 timmar)
- Frö ut HeLa-celler i 5 150 mm plastskålar cellkultur i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)-hög glukos-medium, så att de kommer att nå cirka 80% konfluens med följande dag (ungefär 5 x 10 8-celler). Det är viktigt att cellerna inte når 100% konfluens.
- Nästa dag späddes Strep-märkta lager influensavirus i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,3% bovint serumalbumin (BSA) till en multiplicitet av infektion av 3.
- Avlägsna tillväxtmedium från cellerna, tvätta en gång med PBS, och tillsätt 10 ml PBS innehållande viruset till cellerna. Inkubera under 1 h vid rumstemperatur.
- Ersätta infektion mediet med DMEM-hög glukos, och fortsätter inkubationen vid 37 ° C.
2. Subcellulär fraktionering (3 h)
- Tvätta cellerna en gång med kall PBS och sedan suspendera cellerna i kall PBS med en gummiskrapa och överför till ett 50 ml koniskt rör.
- Pelletera celler i en bordsskiva centrifug under 5 min vid 1000 varv per minut och aspirera PBS.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 ml kall sackaros-buffert (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM Mg-acetat (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sackaros, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1% proteas-inhibitor blandning) . Efter suspension passerar celler genom en 200 mikroliter pipettspets fäst till en 10 ml plast-serum pipett för att störa cellklumpar.
- Inkubera 10 min på is. Försiktigt Vänd med jämna mellanrum för att återsuspendera celler.
- Tillsätt Nonidet P-40 (NP-40) till en slutlig koncentration av 0,5% och virvel vid hög hastighet under 15 sek. Omedelbart centrifugera i 10 min vid 3500 xg vid 4 ° C i en bordsskiva centrifuGE.
- Avlägsna supernatanten och förvara vid 4 ° C. Detta är den cytoplasmatiska fraktionen. Pelleten ska vara mindre och vitare än den ursprungliga cellen pelleten. Alla fraktioner kan lagras under minst 4 h vid 4 ° C.
- Tvätta pelleten i 5 ml kall sackaros-buffert, åter-centrifug såsom i steg 2,5 och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera pelleten (innehållande kärnor) i 1,5 ml kall nucleoplasmic extraktionsbuffert (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% proteas-inhibitor-blandning).
- Överföring till en kyld, helt i glas 4 ml Dounce homogenisator med en tättslutande mortel och homogenisera kärnorna med 20 slag.
Undvik skumbildning under homogenisering. Motståndet bör öka efter ca 10 slag. Effektiv homogenisering kan bekräftas under ett faskontrastmikroskop. - Överföra den homogeniserade kärnorna till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och inkuberades 20 min på ett roterande hjul vid 4 °C.
- Centrifugera vid 16000 x g i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 10 minuter.
- Avlägsna supernatanten och förvara vid 4 ° C. Detta är den nucleoplasmic fraktionen.
- Återsuspendera pelleten i 1,5 ml digerering buffert (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% proteas-inhibitor mix, 100 U / ml Benzonase (för RNA-analys, i stället för med 20 U / ml RNas -fritt DNas I)) förvärmd till 37 ° C och inkubera 10 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 42 pl av 5 M NaCl (för slutlig koncentration av 150 mM NaCl) och inkubera 20 minuter ytterligare vid 4 ° C.
- Centrifugera vid 16000 x g i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 10 minuter.
- Avlägsna supernatanten och förvara vid 4 ° C. Detta är CH150 fraktionen.
- Återsuspendera pelleten i 1,5 ml kall buffert med hög salthalt (50 mM HEPES, pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% proteas-inhibitor blandning) och inkubera 20 minuter på is.
- Centrifugera vid 16.000 x g </ Em> i en mikrocentrifug vid 4 ° C i 10 minuter.
- Avlägsna supernatanten och förvara vid 4 ° C. Detta är den ch500 fraktionen.
3. Strep-tagg Rening (2 h)
- Tillsätt 300 pl av 5 M NaCl till den cytoplasmatiska fraktionen (till en slutlig koncentration av 150 mM NaCl).
- Alikvot 100 pl av packade Strep-Tactin Sepharose-pärlor per fraktion i en 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 10 volymer Strep tvättbuffert (20 mM HEPES, pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl för ch500 prov), 1 mM EDTA) till pärlorna, invertsocker röret för att blanda, och centrifugera 5 min vid 1000 x g i en bordsskiva centrifug.
- Kasta bort supernatanten och upprepa steg 3,3 gånger och sedan suspendera pärlpelleten under en lika stor volym av Strep tvättbuffert.
- Tillsätt 200 pl av tvättade Strep-Tactin vulst uppslamning till varje fraktion (i 1,5 ml mikrocentrifugrör för nuceloplasmic och CH150 och ch500 fraktioner och en 15 ml koniskt rör för cytoplasmisk fraktion).
- RoteraRören 1 h vid 4 ° C på ett roterande hjul.
- Centrifugera rören 1 min vid 1000 x g vid 4 ° C. Kassera supernatant.
- Tillsätt 1 ml kall buffert Strep tvätt till varje rör. Överföring pärlor från 15 ml rör (cytoplasmatisk fraktion) till 1,5 ml rör. Tvätta alla rören 1 min vid 4 ° C, centrifugering efter som i steg 3.7. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
- Efter det sista tvättsteget, avlägsna alla spår av tvättbuffert med användning av en platt pipettspets. Tillsätt 100 pl elueringsbuffert (Strep tvättbuffert innehållande 2,5 mM destiobiotin) och blanda försiktigt.
- Inkubera 15 min på is. Blanda försiktigt pärlor ibland genom att knacka på botten av rören.
- Centrifugrör 1 min vid 1000 x g vid 4 ° C i mikrocentrifug. Samla supernatanten innehållande eluerade Strep-märkta vRNPs.
4. Representativa resultat
Effektiviteten av fraktioneringen bäst bedömdes genom Western blot-analys av de fraktionerade lysat med användning av Antibodies specifika för subcellulära markörer (fig. 2). Närmare bestämt bör framgångsrik subnuclear fraktionering visar liten eller ingen cellulärt RNA-polymeras II (Pol II) i nucleoplasmic, eller lösligt nukleär fraktion 4, och mest bör extraheras med 150 mM NaCl 5. En nedbrytning av Pol II har också reproducerbart observeras i influensa virus-infekterade celler jämfört med oinfekterade celler, i överensstämmelse med litteraturen 6.
Rening av vRNPs bäst bedömdes genom silver eller Coomassie-färgning, såsom visas för en cytoplasmatisk eluatet i fig.. 3. Enligt vår erfarenhet är mest Strep-PB2 renas i en del av en helt formad vRNP, fångas dvs lite lösligt polymeras. Detta återspeglas i höga NP: PA/PB1/PB2 förhållandet observeras av silver eller Coomassie-färgning. En lägre förhållande antyder buffert kontaminering med RNaser, eftersom flera allmänt utbredda RNaser (såsom RNas A) är kända för att klyva RNA på ett sådant sätt att dissociåt polymeras från NP-multimerer 7. Intressant nog behandling med Benzonase enbart, medan tillräcklig för att smälta viralt RNA, verkar inte ha någon effekt på de stökiometriska förhållandena av vRNP proteiner. Även om vi inte kan förklara detta fenomen, observerade vi störningar i vRNPs efter uppslutning med andra RNaser (data visas ej), vilket antyder att Benzonase kan lämna vissa strukturellt viktiga RNA regioner intakt. Efter rening av vRNPs från cytoplasman och nukleoplasman (utföras utan nukleas-digerering), kan 8 svaga men diskreta band vid höga molekylvikter observeras genom silverfärgning, vilket motsvarar de förutsagda molekylvikterna för de 8 segmenten influensavirus genomet (se ref. 3 ).
De relativa mängderna av vRNPs renade från varje fraktion vid 9 h efter infektion visas i Figur. 4. Fördelningen av vRNPs varierar under loppet av infektionen, med starkast ackumulering i CH150 fraktionen vid tidiga tidpunkter, ochökad ackumulering i nukleoplasman och cytoplasman vid sena tidpunkter.
Figur 1. Flödesschema för subcellulär fraktionering. Anpassad från ref. 3.
Figur 2. Western blot-analys av subcellulära fraktioner från influensa-virus-infekterade celler. 10 9 HeLa-celler infekterade med influensa-virus stam WSN i 9 timmar före subcellulär fraktionering. Lika stora mängder av totalt protein laddades i varje bana och analyserades med användning av de visade antikroppar. RNA-polymeras II (Pol II) detekterades med användning av klon 8WG16, som igenkänner alla former av den C-terminala domänen (det hypofosforylerade bandet är mest framträdande). Anpassad från ref. 3.
Figur 3.Silverfärgning analys av renat vRNPs. HeLa-celler infekterades med rWSN (som negativ kontroll) eller rWSN-PB2-Strep under 9 h, följt av strep rening från den cytoplasmatiska fraktionen. Asterisken betecknar band som ej är synliga efter RNas-spjälkning. Anpassad från ref. 3.
Figur 4. Silverfärgningsanalys av vRNPs renade från olika cellulära fraktioner. 10 9 HeLa-celler infekterades med rWSN-PB2-Strep eller rWSN under 9 h, följt av subcellulär fraktionering och Strep rening. Lika stora mängder av eluatet från varje fraktion laddades. Anpassad från ref. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan många studier har nyligen identifierat enskilda proteiner eller cellulära nätverk som deltar i influensavirusinfektion 8 förblir den funktionella betydelsen av de flesta av dessa interaktioner oklar. Med tanke på absolut beroende av kromatin-baserade funktioner för influensa-virus-RNA-syntes och komplexet biofysiska och biokemiska natur kärnan 9, kommer nya tekniker krävas för att belysa dessa funktioner. Den subnuclear fraktionering vi presenterar här, tillsammans med affinitet rening av vRNPs tillåter karakterisering av viktiga virala RNA fabriker som tidigare var otillgängliga.
Många subcellulär fraktionering protokoll har tidigare beskrivits i litteraturen. Vi observerade att de flesta av dessa traditionella metoder att leda till alltför tidigt läckage av vRNPs från kärnan, ett fenomen som beskrivs också för Pol II 10. Genom att använda en kort inkubation av i förväg svällda celler med en låg concentration av en svag detergent, NP-40, förekom effektiv plasmamembranet lys utan signifikant nukleär läckage. Intressant nog att utföra vår subcellulär fraktionering med användning av A549 och HEK293T-celler i stället för HeLa-celler ledde till stark nukleär läckage av vRNPs i båda cellinjerna. Sänka NP-40 koncentration av approximativt 0,2% minskas detta problem, men på grund av någon variation av dessa cellinjer, bör optimala betingelser bestäms empiriskt. En annan möjlig altermative är användningen av icke-humant, influensavirus-mottagliga cellinjer såsom MDCK eller Vero-celler.
Vår saltextraktion protokollet skiljer sig från traditionella förfaranden kromatin utvinning som ofta använder lägre salthalter och / eller hög EDTA koncentrationer. Vår protokollet separerar kromatin i två specifika fraktioner, en Pol II-high/histone-low fraktion och dess ömsesidiga. Emellertid kan andra kromatin extraktionsmetoder också kompatibel med affinitet rening av VRNPs. Eftersom de flesta kromatin extraktionsförfaranden har fokuserat på DNA-protein-interaktioner i jämförelse med protein-protein interaktioner, är nya tekniker för att extrahera tätt kromatin-bundna multi-protein-komplex 11.
I allmänhet bör längden av infektion bestämmas empiriskt beroende på variationer hos virusstammar och cellinjer. Med användning av rWSN-PB2-Strep-stam vid ett MOI av 3, har vi utfört subcellulär fraktionering vid tidpunkter varierande från 3 till 10 h efter infektion. Enligt vår erfarenhet ger mindre än 3 h av infektion för få renade vRNPs för användbar Western blot-analys, medan infektion längre än 3 h resulterar i en stark cytopatisk effekt och en efterföljande blandning av fraktioner.
Förmågan att isolera intakta, tätt kromatin-bundna virala komplex öppnar upp flera möjligheter. Medan man utnyttjade ett rekombinant virus som uttrycker en Strep-märkt PB2, kan andra affinitetsmarkörer också användas, såväl som traditional immunoprecipitation inriktning andra virala proteiner. Vidare, medan vår analys av vRNPs var begränsad till karakteriseringen av deras protein-och RNA-komponenter, kan de renade komplexen även användas för att utföra funktionell syntes in vitro-analyser. Slutligen kan separationen av vRNPs till grova funktionella arter genom subnuclear fraktionering möjliggör även att ju närmare studie av flera nyligen beskrivna posttranslationella modifieringar av virala proteiner som krävs för effektiv viral RNA-syntes 12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nada Naffakh och Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) för rWSN-PB2-Strep virus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
