Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

doi: 10.3791/4032 Published: August 8, 2012

Summary

توضح هذه المقالة لأول مرة إجراء لعزل الخلايا البطانية الإنسان من عروق السري ثم يوضح كيفية استخدام هذه الخلايا لدراسة هجرة العدلات في ظل ظروف التدفق. باستخدام غرفة تدفق كميات قليلة مصنوعة من البوليمر مع الخصائص البصرية للزجاج، ويعيش خلية التصوير فلوري للسكان الخلية نادر ممكن أيضا.

Abstract

العدلات هي النوع الأكثر وفرة من خلايا الدم البيضاء. وهم يشكلون جزءا أساسيا من نظام المناعة الفطرية 1. أثناء التهاب حاد، العدلات هي خلايا التهابية 1 إلى الهجرة إلى موقع الإصابة. تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة عملية متدرجة تشمل الأولى، تمدد الأوعية الدموية لزيادة تدفق الدم، وثانيا، تغييرات هيكلية الاوعية الدموية الدقيقة والهروب من بروتينات البلازما من الدم؛، المتداول 3 التصاق، والتهجير من العدلات في جميع أنحاء البطانة، ورابعا تراكم من العدلات في موقع الإصابة 2،3. وقد تطورت وهناك مجموعة واسعة من في والمجراة في المختبر طرق لتمكين دراسة هذه العمليات 4. هذه الطريقة تركز على هجرة العدلات عبر الخلايا البطانية الإنسان.

أسلوب واحد شعبية لدراسة العمليات الجزيئية تشارك في التهجير العدلة يستخدم ن الإنسانeutrophils التفاعل مع الخلايا البشرية الأساسية بطانة الوريد السري (HUVEC) 5. وقد وصفت العدلة العزلة بصريا في مكان آخر وبالتالي هذه المادة سوف تظهر طريقة لعزل HUVEC. عزل مرة واحدة ونمت لالتقاء، يتم تنشيط الخلايا البطانية مما أدى إلى upregulation من جزيئات الالتصاق والتنشيط. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا البطانية مع السيتوكينات مثل TNF-α النتائج في زيادة selectin-E و IL-8 التعبير 7. E-selectin يتوسط التقاط والمتداول من العدلات و IL-8 تفعيل يتوسط والتصاق شركة من العدلات. بعد العدلات التصاق transmigrate. يمكن أن يحدث التهجير paracellularly (من خلال تقاطعات الخلية البطانية) أو transcellularly (من خلال الخلية البطانية نفسها). في معظم الحالات، وهذه التفاعلات تحدث في ظل الظروف الموجودة في تدفق 7،8 الأوعية الدموية.

تدفق مواز لوحة الغرفة هو نظام يستخدم على نطاق واسع أن ميلميكروفونات الضغوط العثور على القص الهيدروديناميكية في الجسم الحي، وتمكن هذه الدراسة من تجنيد العدلات تحت حالة تدفق 9،10 في المختبر. العديد من الشركات تنتج مواز غرف تدفق لوحة ولكل منها مزاياه وعيوبه. اذا كانت هناك حاجة فلوري والتصوير، والزجاج أو البوليمر مماثلة بصريا يحتاج إلى استخدامها. الخلايا البطانية لا تنمو بصورة جيدة على الزجاج.

هنا نقدم وسيلة سهلة وسريعة لتصوير التخلص النقيض من ذلك، ومدينة دبي للإنترنت فلوري من هجرة العدلات منخفض باستخدام قناة ibidi حجم الشريحة مصنوعة من البوليمر الذي يدعم التصاق السريع ونمو الخلايا البطانية الإنسان والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها مع الزجاج. في هذه الطريقة، ونمت الخلايا البطانية وحفزت في μslide ibidi. وأدخلت في ظل ظروف تدفق العدلات وجرى تقييم التهجير. تمكين التصوير فلوري من تقاطعات في الوقت الحقيقي وتحديد مدى paracellular مقابلالعابر للهجرة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. العزلة وصيانة خلايا الإنسان بطانة الأوعية الدموية

  1. يجب أن تستخدم المستوى 2 إجراءات السلامة البيولوجية عند العمل مع الدم والأنسجة البشرية. قطع مقص باستخدام حبل من المشيمة ومن ثم النظر عن كثب في الحبل السري لتجلط الدم والأضرار الناجمة عن لقط الحبل أثناء الولادة. قطع وتجاهل هذه الأجزاء من الحبل السري.
  2. إعداد الطازجة حل كولاجيناز في 1 ملغ / مل بصب 50 مل من عازلة الحبل الدافئ في أنبوب يحتوي على 50 ملغ كولاجيناز.
  3. تغيير في قفازات معقمة وفتح علبة تحتوي على صك مشبع cannulas حادة معقمة، والمشابك الحبل، ومقص، وثلاثة في اتجاه ووقف الديوك والشاش في رقائقي تدفق غطاء محرك السيارة.
  4. التعرف على الشرايين اثنين والحاضر وريد واحد في السلك. الشرايين هي أصغر حجما وتميل الى ان تكون مقيدة بإحكام، في حين أن وريد كبير وسهل على يقني؛ يدخل القنية. تدفق الدم من الوريد، تضاف بلطف قنية مع محبس اتجاهين مرفقة به أناn لنهاية واحدة من الوريد ومكان المشبك حول قنية لأنه عقد بحزم في موقف. يروي العازلة سلك عن طريق الوريد. كرر حتى من خلال تدفق غير واضح ومن ثم المشبك في نهاية الحبل.
  5. كولاجيناز يروي في الوريد، إغلاق محبس، ووضع الحبل في كوب دافئ العازلة التي تحتوي على النخاع واحتضانها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقيقة، وإزالة الحبل السري وتدليك بلطف الحبل على تخفيف الخلايا البطانية من التجويف من الوريد. استنزاف المحلول في أنبوب يحتوي على وسائل الاعلام الخلية البطانية (ECM). مطاردة مع عازلة الحبل مرتين لإزالة الخلايا المتبقية. استنزاف الحل في الأنبوب نفسه.
  6. منبذة الخلايا في 350 XG لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا البطانية.
  7. إزالة طاف وإضافة 10 مل من ECM لبيليه. resuspend بلطف الخلايا في ECM، ثم نقل الخلايا إلى قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وقد تم ذلك قبل طلاء الجيلاتين مع ما لا يقل عن 1 ساعة على 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا على 37 درجة مئوية و 5ثاني أكسيد الكربون بنسبة 2٪.
  8. في اليوم التالي، هز بلطف القارورة لطرد أي خلايا الدم الحمراء إزالة ثم طاف وتغسل بمحلول هانك دافئ وملح متوازن (HBSS). إزالة HBSS وتغذية الخلايا مع 10 مل من ECM دافئ. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن تمت إزالة خلايا الدم الحمراء. تقييم درجة التقاء والصرف من الخلايا البطانية. وينبغي أن ممدود الخلايا البطانية في هذه المرحلة مع أي علامة على فجوات.
  9. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام حتى تصل إلى خلايا confluency، ثم انقسام الخلايا باستخدام محلول 0.08٪ من التربسين التي تحتوي على 1MM EDTA. لوحة الخلايا البطانية في أطباق المطلوب مسبقا المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين. وينبغي أن تصل إلى نقطة التقاء الخلايا في 3-6 أيام.
  10. عند استخدام ibidi الغرف، قبل معطف كل غرفة مع 0.2٪ الجيلاتين. إزالة الزائدة الجيلاتين وفبرونيكتين ثم إضافة 1.5 X 10 6 / مل من الخلايا البطانية علقت في ECM الى غرفة. تغيير وسائل الاعلام كل يوم آخر حتى جonfluent. وينبغي أن تكون خلايا متكدسة في 2-3 أيام اعتمادا على الحبل.

2. إعداد العدلات

  1. تم عزل العدلات من الدم المحيطي من متطوعين من البشر الأصحاء باستخدام الطرد المركزي كثافة. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل مع مظاهرة البصرية للعزلة العدلة في هذه القضية في وقت سابق من هذه المجلة 6. المعزولة مرة واحدة، العدلات resuspend بتركيز 1x10 مل / 6 في HBSS تحتوي على الزلال البشري بنسبة 0.5٪.

3. إنشاء غرفة Ibidi

  1. زراعة خلايا بطانية في غرفة ibidi الجيلاتين المغلفة. فحص لهم كل يوم باستخدام المجهر النقيض من المرحلة حتى تصبح متجمعة بشكل محكم.
  2. تحفيز الخلايا البطانية لزيادة التعبير عن جزيئات الالتصاق والتنشيط. لأغراض هذا البروتوكول، وحفز الخلايا البطانية مع 10 نانوغرام / مل من المؤتلف TNF-α لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪
  3. تحضير المجهر، ومضخة محقنة كما هو موضح من قبل بصريا فيسه وزملاؤه 11 باستخدام غرفة ibidi فارغ.
  4. الخلافات الرئيسية بين هذا البروتوكول وإجراء فيسه وتشمل ما قبل ملء أنبوب لمنع التعرض للخلايا بطانية للهواء، والحفاظ على المنطقة العازلة عند 37 درجة مئوية باستخدام حمام ماء، وذلك باستخدام أنبوب PharMed للحفاظ على المنطقة العازلة من فقدان الحرارة، واستخدام مختلف أهداف على المجهر اعتمادا على ما إذا التصوير مع النقيض من مرحلة أو مضان.
  5. مرة واحدة تم تعيين مجهر صعودا ويتم ملء الأنبوب مع HBSS، على مقربة من جميع الصمامات وإزالة غرفة ibidi فارغ.
  6. ربط الغرفة التي تحتوي على ibidi TNF-α حفز الخلايا البطانية للأنابيب.

4. العدلة التوظيف والتهجير

  1. تصور أحادي الطبقة الخلية البطانية في microscمكتب مستشار رئيس الوزراء باستخدام النقيض من مرحلة 10X الهدف.
  2. تعيين مضخة محقنة لسحب ويبدأ تدفق HBSS في إجهاد القص المطلوب (عادة ما بين 0.5 إلى 2 سم / DYN 2).
  3. على الجانب مدخل، والتحول من HBSS إلى العدلات المعزولة (1x10 6 / مل) من خلال تحويل الطريق لمدة ثلاثة وقف الديك.
  4. بدء التسجيل باستخدام كاميرا CCD متصلة إما إلى مسجل DVD أو متصلة مباشرة إلى الكمبيوتر. بدء موقت عندما العدلات أدخل غرفة. يروي العدلات لمدة اربع دقائق. ما مجموعه 3 مل من تعليق العدلة كافية لتجربة واحدة.
  5. بعد أربع دقائق، يعود مرة أخرى الى HBSS لمنع الحجز على العدلات جديد. إذا ما المطلوب بيانات عن التفاعلات الكلية، المتداول والتصاق شركة، صورة 6 حقول عشوائية لمدة 10 ثانية كل باستخدام النقيض مرحلة 10X الهدف بين 4 و 5 دقائق.
  6. التحول إلى هدف وتسجيل 40X حقل واحد من عرض ما بين 5 و 10 دقائق. في 10 دقيقة، وجمعبين 5 و 10 حقول عشوائية من الرأي.
  7. وقف تدفق والانتقال إلى الغرفة التالية.

5. فلوري التصوير تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة Ibidi

  1. الخلايا البطانية التسمية أو العدلات مع التحقيق الذي تجريه فلوري من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن استخدام الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] لتصور تقاطعات الخلية البطانية.
  2. التجمع ibidi غرفة في المجهر مع تباين تدخل الفرق (DIC) وقدرات فلوري. نستخدم 1000 FluoView مبائر (أوليمبوس) مع غرفة البيئية. تركز باستخدام هدفا مصممة للعمل في مدينة دبي للإنترنت وفلوري.
  3. الحصول على الصور في وقت واحد، ومدينة دبي للإنترنت فلوري باستخدام البرمجيات التي توفرها بائع بينما بعد الدورة مرة وصفها في الفقرة 4.

6. تحليل التوظيف العدلات

  1. وصفت تحليل المتداول والتفاعل من قبل خلايا فيسه وآخرون 11. لقياس نسبة العدلات المتداول على أحادي الطبقة البطانية تحصي أعداد العدلات التي انتقلت أكثر من قطر خلية في الفترة من 5 ثوان. تقسيم هذا العدد من اجمالي عدد الكريات البيض في هذا المجال لتحديد نسبة الخلايا المتداول. وبالتالي، تعتبر الخلايا المتبقية تمسكا راسخا.
  2. قياس سرعة المتداول من العدلة عن طريق حساب المسافة العدلة سافر في فترة زمنية معينة ومن ثم تقسيمه في ذلك الوقت في ثوان.
  3. يتم تحديد التهجير من قبل حساب عدد العدلات التي غيرت شكل وهاجروا تحت أحادي الطبقة 10. ويتم تحديد هذه العدلات من حقيقة ان يغيروا من كونها مرحلة مشرقة عندما على رأس أحادي الطبقة إلى مرحلة مظلما عندما تحت أحادي الطبقة 10. ويمكن التعبير عن عدد الخلايا transmigrated كنسبة مئوية من مجموع الخلايا في مجال الرؤية أو على شكل خدر الخامإيه من الخلايا transmigrated في وحدة المساحة. في هذا النظام النموذجي، وعادة 50٪ من العدلات transmigrate بعد 10 دقائق.

7. ممثل النتائج

الخلايا البطانية Unstimulated لا تدعم تجنيد العدلات. في المقابل، وتنشيط الخلايا البطانية مع TNF-α النتائج في المتداول العدلة، التصاق وطيد والتهجير. ويرد مثال على هذه البيانات في الشكلين 1 و 2. الشكل 1A يظهر العدلات التفاعل مع TNF-α-حفز الخلايا البطانية. يمكن قياس هذه التفاعلات، وكشف عن عدد من العدلات التفاعل مع الخلايا البطانية، فضلا عن عدد من العدلات المتداول، وتمسكا راسخا أو transmigrated (الشكل 2). يمكن للهجرة العدلات تحدث في التقاطعات الخلية أو عن طريق الخلايا البطانية أنفسهم. للتمييز بين هذين الشرطين، وصفت الخلايا البطانية مع مضاد-C-VE وسجل adherin الأجسام المضادة والتهجير كما يحدث paracellularly أو transcellularly (الشكل 1B و C). في هذا النموذج، وتقريبا جميع التهجير هو paracellular 7.

الشكل 1
الشكل 1. مدينة دبي للإنترنت في وقت واحد والتصوير مضان تحت ظروف تدفق باستخدام غرفة ibidi. (أ) صورة مدينة دبي للإنترنت معزولة حديثا العدلات البشرية المهاجرة عبر خلايا بطانة الوريد السري. رأس السهم الأصفر يظهر تمسكا العدلة، ورأس السهم الأبيض يظهر العدلة transmigrating. (ب) وملطخة تقاطعات الخلايا البطانية مع الأجسام المضادة لمكافحة VE-كادهيرين مترافق إلى ترتيب، [547] والمصورة. (ج) يظهر تراكب من قناة A و B كشف أن جميع transmigrating في هذا النموذج هو paracellular. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

_content "> الشكل 2
الشكل 2. تركت unstimulated الخلايا البطانية أو وحفز مع 10 نانوغرام / مل من TNF-α. بعد 4 ساعات، وتدفق لوحة موازية غرفة تجميعها وكانت perfused العدلات عبر DYN في 1 / سم 2. (أ) تم فحص التفاعلات العدلات وتقاس باستخدام يماغيج البرنامج من المعاهد الوطنية للصحة. وتميزت هذه الخلايا المتفاعلة مجموعها (B) المتداول، تمسكا راسخا أو transmigrating (C). البيانات تمثل الوسط ووزارة شؤون المرأة + من بين 3 و 5 من التجارب. وكان الفرق بين الرقابة وTNF في لوحات وجيم معنوية (P <0.001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد استخدم الباحثون بصورة روتينية الخلايا البطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة لدراسة تجنيد العدلات والتهجير. ومن الأمثلة على ذلك، ولكنها لا تقتصر على، وخلايا الجلد بطانة الاوعية الدموية الدقيقة 12، الكبد الخلايا البطانية الجيبية 13 و الخلايا البطانية من الوريد السري الإنسان 10. من بينها اكتسبت شعبية واسعة HUVEC بسبب سهولة النسبية من العزلة وتوافر. HUVEC هي قوية في نظام نموذج المختبر الذي يحاكي العمليات البطانية الكثيرة التي تحدث في الجسم الحي. وقد ساعد هذا النظام النموذجي في تحديد جزيئات الالتصاق وكيموكينات حاسم في تجنيد العديد من الفئات الفرعية الكريات البيض، وتحليل مفصل لكيفية تمكين ويتم تنظيم هذه العمليات. العمل في المختبر مع HUVEC شكلت الأساس لفي الدراسات المجراة أنه في نهاية المطاف وفرت فهم أفضل وعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان 14.

e_content "> في هذه الورقة نقدم طريقة سريعة وبسيطة لدراسة تجنيد العدلات في المختبر باستخدام غرفة تدفق ibidi. هذا النوع من الغرفة لديها العديد من المزايا الأخرى غرف لوحة مواز وصف في وقت سابق من هذه المجلة 11. مصنوعة غرف Ibidi تتكون من البوليمر مع الخصائص البصرية مماثلة للزجاج التي تمكن المستخدم من التقاط صور الفلورسنت ومدينة دبي للإنترنت، بالإضافة إلى التخلص النقيض من الصور، وهناك غرف التي تستخدم coverslips زجاج لتمكين التصوير فلوري، ولكنها تنمو الخلايا البطانية على الزجاج يشكل تحديا لأن التصاق ممتلكات من هذه الخلايا بشكل كبير على تغيير الواجهات الزجاجية 15. الخلايا البطانية تلتزم بشكل جيد لسطح البلاستيك لكن التصوير مضان على سطح من البلاستيك ليست قابلة للتحقيق. باستخدام μ ibidi الشرائح ليس فقط نتخلص من هذه المشاكل ولكن أيضا أنها تتطلب أقل من ذلك بكثير حجم عينة من أساليب أخرى . هذه الشرائح تمكن أيضا تجارب موازية في وقت واحد مع طفيف فقط modificأوجه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور بينا Colarusso والتصوير الخلية الحية مرفق على المساعدة التي قدموها مع التصوير وتحليل الصور، والسيدة Lailey للحصول على المساعدة الفنية لها، وحدة 51 في مستشفى التلال في كالغاري، أب لتوفير الحبل السري البشري. الدكتور د. باتل هو يبتدع ألبرتا: الصحة حلول عالم. وأيد هذا العمل من قبل منحة التشغيل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمنح والمعدات والبنية التحتية من المؤسسة الكندية للإبداع والعلوم ألبرتا والسلطة البحوث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197
Cord buffer Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM) M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016
Ibidi chambers Ibidi 80606
TNF-α Prepro Tech 300-01A
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).More

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter