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Immunology and Infection

मानव नाल की नस Endothelial फ्लो शर्तों के तहत और न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन के अध्ययन में उनके उपयोग के कक्ष के अलगाव

doi: 10.3791/4032 Published: August 8, 2012

Summary

यह लेख पहले endothelial कोशिकाओं मानव नाल की नसों से अलग करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है और तब पता चलता है कि कैसे इन कोशिकाओं का उपयोग करने के प्रवाह की शर्तों के तहत न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन जांच. एक प्रवाह कम मात्रा कक्ष कांच की ऑप्टिकल विशेषताओं के साथ एक बहुलक से बना का उपयोग करके, दुर्लभ सेल आबादी के रहने कक्ष फ्लोरोसेंट इमेजिंग भी संभव है.

Protocol

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1. अलगाव और मानव संवहनी endothelial सेल के रखरखाव

  1. स्तर 2 जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं मानव रक्त और ऊतक के साथ कार्य करते समय किया जाना चाहिए. का प्रयोग कैंची नाल से रस्सी काट और फिर निकट खून के थक्कों और प्रसव के दौरान गर्भनाल clamping के द्वारा होने वाली क्षति के लिए की हड्डी की जांच. बाहर कट और रस्सी के इन भागों त्यागें.
  2. एक ट्यूब है कि 50 मिलीग्राम Collagenase में गर्म कॉर्ड बफर के 50 मिलीलीटर गिरने से 1 मिलीग्राम / एमएल ताजा Collagenase समाधान तैयार.
  3. बाँझ दस्ताने में बदलें और एक autoclaved साधन निष्फल कुंद cannulas, गर्भनाल clamps, कैंची, तीन तरह बंद लंड और लामिना का प्रवाह हुड में धुंध वाले ट्रे खुला.
  4. दो धमनियों और हड्डी में एक नस वर्तमान पहचानें. धमनियों छोटे होते हैं और कस constricted हो जाते हैं, जबकि नस बड़ी और cannulate करने के लिए आसान है. मैं नस से खून फ्लश, धीरे इसे से जुड़े एक दो तरह से पानी निकलने की टोंटी के साथ एक प्रवेशनी सम्मिलितसहेजे नस और जगह प्रवेशनी स्थिति में मजबूती से पकड़ के चारों ओर एक क्लैंप के एक छोर. नस के माध्यम से गर्भनाल बफर छिड़कना. दोहराएँ जब तक प्रवाह के माध्यम से स्पष्ट है और फिर रस्सी का अंत दबाना.
  5. नस में व्याप्त करना Collagenase, पानी निकलने की टोंटी को बंद करने के लिए, एक 10 मिनट के लिए गर्म कॉर्ड बफर और सेते हैं युक्त बीकर में गर्भनाल जगह. 10 मिनट के बाद, गर्भनाल को हटा दें और धीरे नस के लुमेन से endothelial कोशिकाओं को ढीला करने की हड्डी की मालिश. Endothelial सेल मीडिया (ईसीएम) युक्त ट्यूब में समाधान नाली. कॉर्ड बफर से भरा दो बार शेष कोशिकाओं को हटाने के लिए. उसी ट्यूब में समाधान नाली.
  6. 350 XG में गोली से 10 मिनट के endothelial कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
  7. निकालें सतह पर तैरनेवाला और गोली ईसीएम की 10 मिलीलीटर जोड़ें. धीरे से ईसीएम में के कोशिकाओं resuspend, तो एक T75 0.2% जेलाटीन के साथ पूर्व में लिपटे कुप्पी कोशिकाओं हस्तांतरण. जेलाटीन के साथ पूर्व कोटिंग 37 डिग्री सेल्सियस पर दिया गया है कम से कम 1 घंटे के लिए किया 37 में कोशिकाओं को विकसित डिग्री सेल्सियस और 5% 2 सीओ.
  8. अगले दिन, धीरे कुप्पी शेक करने के लिए जगह देना किसी भी लाल रक्त कोशिकाओं को फिर से सतह पर तैरनेवाला हटाने और गर्म हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) से धो. HbSS निकालें और गर्म ईसीएम के 10 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं फ़ीड. खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दिया गया है. संगम और endothelial कोशिकाओं की आकारिकी की डिग्री का मूल्यांकन. इस स्तर पर Endothelial कोशिकाओं vacuoles के कोई संकेत नहीं के साथ लम्बी किया जाना चाहिए.
  9. हर तीन दिन मीडिया को बदलने के लिए जब तक कोशिकाओं confluency, तो विभाजित trypsin की 0.08% 1mm EDTA के समाधान युक्त का उपयोग कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए आगे बढ़ें. थाली हैं वांछित बर्तन में endothelial कोशिकाओं के साथ 0.2% जेलाटीन पूर्व लेपित. कोशिकाओं को 3-6 दिनों में संगम तक पहुँचने चाहिए.
  10. जब ibidi कक्षों, पूर्व कोट प्रत्येक कक्ष का उपयोग कर 0.2% जेलाटीन के साथ. निकालें अतिरिक्त जेलाटीन और fibronectin और फिर जोड़ने 1.5 10 6 endothelial कोशिकाओं के कक्ष में ECM में निलंबित एमएल / एक्स. मीडिया हर दूसरे दिन बदल ग तकonfluent. कोशिकाओं रस्सी पर निर्भर करता है 2-3 दिनों में मिला हुआ होना चाहिए.

2. Neutrophils की तैयारी

  1. Neutrophils स्वस्थ मानव स्वयंसेवकों के घनत्व centrifugation का उपयोग परिधीय रक्त से अलग थे. और न्युट्रोफिल अलगाव के लिए एक दृश्य प्रदर्शन के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल इस 6 पत्रिका के पहले अंक में पाया जा सकता है. 0.5% मानव albumin युक्त HbSS में 1x10 6 एमएल / एकाग्रता में एक बार अलग resuspend neutrophils.

3. ऊपर Ibidi चैंबर की स्थापना

  1. जेलाटीन - लेपित ibidi कक्ष में endothelial कोशिकाओं को विकसित. उन्हें हर दिन जांच माइक्रोस्कोपी चरण विपरीत का उपयोग कर जब तक वे कसकर मिला हुआ हो.
  2. Endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित करने के आसंजन सक्रियण अणुओं की अभिव्यक्ति वृद्धि. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, endothelial कोशिकाओं 10/37 एनजी पुनः संयोजक TNF-α के चार घंटे के लिए एमएल के साथ प्रेरित किया गया डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ
  3. माइक्रोस्कोप, और सिरिंज पंप के रूप में नेत्रहीन Wiese और उनके सहयोगियों ने 11 से वर्णित एक खाली ibidi कक्ष का उपयोग कर तैयार है.
  4. इस प्रोटोकॉल और Wiese प्रक्रिया के बीच मुख्य अंतर के पूर्व भरने के लिए हवा के endothelial कोशिकाओं के जोखिम को रोकने के लिए टयूबिंग, 37 में बफर बनाए रखने डिग्री सेल्सियस एक नहाने के पानी का उपयोग, फार्म्ड टयूबिंग का उपयोग करने के लिए तापमान खोने से बफर रखने के लिए और का उपयोग विभिन्न शामिल खुर्दबीन पर उद्देश्यों चरण विपरीत या प्रतिदीप्ति साथ चाहे इमेजिंग पर निर्भर करता है.
  5. एक बार माइक्रोस्कोप की स्थापना की है और टयूबिंग HbSS, करीब सभी stopcocks से भरा है और खाली ibidi कक्ष हटा.
  6. कनेक्ट ibidi कक्ष युक्त TNF-α टयूबिंग के लिए endothelial कोशिकाओं को प्रेरित.

4. न्युट्रोफिल भर्ती और स्थानांतरगमन

  1. Microsc में endothelial सेल monolayer की कल्पनाएक 10x चरण विपरीत उद्देश्य का उपयोग ope.
  2. सिरिंज पंप सेट को वापस लेने और वांछित कतरनी तनाव में HbSS का प्रवाह (आम तौर पर 0.5-2 dyn के / 2 सेमी) के बीच शुरू.
  3. प्रवेश तरफ, HbSS से तीन बंद मुर्गा रास्ता बदल कर अलग neutrophils (1x10 6 / एमएल) के लिए स्विच.
  4. रिकॉर्डिंग शुरू करने के एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर एक डीवीडी रिकॉर्डर या तो जुड़े या कंप्यूटर से सीधे जुड़े. टाइमर शुरू जब neutrophils कक्ष में प्रवेश. चार मिनट के लिए neutrophils छिड़कना. न्युट्रोफिल निलंबन के 3 एमएल का कुल एक ही प्रयोग के लिए पर्याप्त है.
  5. चार मिनट के बाद, वापस स्विच करने के लिए नई neutrophils की कुर्की रोकने के HbSS. यदि कुल बातचीत, रोलिंग और फर्म आसंजन के लिए डेटा वांछित हैं, छवि प्रत्येक 10 सेकंड के लिए 6 यादृच्छिक क्षेत्रों में 4 मिनट और 5 के बीच एक 10x चरण विपरीत उद्देश्य का उपयोग कर.
  6. एक 40x उद्देश्य के लिए स्विच और 5 और 10 मिनट के बीच देखने के एकल क्षेत्र रिकॉर्ड. 10 मिनट में इकट्ठा,के बीच 5 और 10 के देखने के यादृच्छिक क्षेत्रों.
  7. प्रवाह बंद करो और अगले कक्ष में ले जाएँ.

5. फ्लो एक Ibidi चैंबर का प्रयोग शर्तों के तहत फ्लोरोसेंट इमेजिंग

  1. लेबल या तो ब्याज की एक फ्लोरोसेंट जांच के साथ endothelial कोशिकाओं या neutrophils. उदाहरण के लिए, एक विरोधी VE-cadherin एलेक्सा [547] संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए endothelial सेल जंक्शनों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और फ्लोरोसेंट क्षमताओं के साथ एक खुर्दबीन पर इकट्ठा ibidi कक्ष. हम एक पर्यावरण चैम्बर के साथ एक FluoView 1000 confocal (ओलिंप) का उपयोग करें. डीआईसी और फ्लोरोसेंट काम के लिए एक डिजाइन उद्देश्य का उपयोग ध्यान दें.
  3. एक साथ डीआईसी और फ्लोरोसेंट विक्रेता द्वारा आपूर्ति की सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए समय पाठ्यक्रम की धारा 4 में वर्णित के बाद छवियों मोल.

6. न्युट्रोफिल भर्ती का विश्लेषण

  1. रोलिंग और बातचीत के दौरान कोशिकाओं का विश्लेषण Wiese एट अल 11 द्वारा वर्णित है. Endothelial monolayer की गिनती न्युट्रोफिल है कि 5 सेकंड की अवधि में एक से अधिक सेल व्यास स्थानांतरित कर दिया की संख्या पर रोलिंग neutrophils का प्रतिशत को मापने. रोलिंग कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए क्षेत्र में leukocytes की कुल संख्या द्वारा इस संख्या में फूट डालो. विस्तार के द्वारा, शेष कोशिकाओं को मजबूती से अनुयायी माना जाता है.
  2. दूरी न्युट्रोफिल एक विशेष समय अवधि में यात्रा की और फिर यह सेकंड में उस समय विभाजन की गणना के द्वारा न्युट्रोफिल की रोलिंग वेग को मापने.
  3. स्थानांतरगमन neutrophils है कि आकार बदल दिया है और 10 monolayer नीचे चले गए की संख्या की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है. इन neutrophils तथ्य यह है कि वे चरण में किया जा रहा है उज्ज्वल से बदल के द्वारा की पहचान कर रहे हैं जब में monolayer चरण अंधेरे 10 monolayer नीचे जा रहा है जब शीर्ष पर. transmigrated कोशिकाओं की संख्या के मद्देनजर क्षेत्र में कुल कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में या एक कच्चे सुन्न के रूप में व्यक्त किया जा सकता हैप्रति इकाई क्षेत्र transmigrated कोशिकाओं की एर. इस मॉडल प्रणाली में, neutrophils की आम तौर पर 50% 10 मिनट के बाद बसना.

7. प्रतिनिधि परिणाम

Unstimulated endothelial कोशिकाओं उदासीनरागी भर्ती समर्थन नहीं करते. इसके विपरीत में, न्युट्रोफिल रोलिंग, फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन में TNF-α परिणाम के साथ endothelial कोशिकाओं उत्तेजक. इन आंकड़ों का एक उदाहरण आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया चित्र 1 ए. TNF-α उत्तेजित endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत neutrophils से पता चलता है. इन मुलाकातों, मात्रा endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत neutrophils की कुल संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोलिंग, दृढ़ता से अनुयायी या transmigrated की (चित्रा 2) neutrophils की संख्या का खुलासा किया जा सकता है. न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन सेल जंक्शनों पर या endothelial कोशिकाओं को स्वयं के माध्यम से हो सकता है. इन दो स्थितियों के बीच अंतर करने के लिए, endothelial कोशिकाओं विरोधी VE - ग के साथ लेबल रहे हैं adherin एंटीबॉडी और स्थानांतरगमन paracellularly या transcellularly घटनेवाला (चित्रा 1 बी और सी) के रूप में रन बनाए है. इस मॉडल में, लगभग सभी स्थानांतरगमन 7 paracellular है.

चित्रा 1
चित्रा 1 एक साथ और प्रवाह एक ibidi कक्ष का उपयोग की शर्तों के तहत प्रतिदीप्ति इमेजिंग डीआईसी. (ए) डीआईसी छवि हौसले से मानव मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं भर में पलायन neutrophils अलग कर. पीले arrowhead एक पक्षपाती न्युट्रोफिल से पता चलता है, सफेद नोक एक transmigrating न्युट्रोफिल से पता चलता है. (बी) Endothelial सेल जंक्शनों विरोधी VE-cadherin एलेक्सा [547] छवि और संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. (सी) चैनल ए और बी खुलासा कि इस मॉडल में लगभग सभी transmigrating paracellular है की उपरिशायी दिखाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

"_content> चित्रा 2
चित्रा 2 Endothelial कोशिकाओं छोड़ दिया गया unstimulated या 10 एनजी / एमएल TNF-α के साथ प्रेरित किया गया. 4 घंटे के बाद, एक समानांतर थाली प्रवाह कक्ष को इकट्ठा किया गया था और neutrophils 1 dyn के / 2 सेमी में भर perfused थे. (ए) न्युट्रोफिल बातचीत की जांच की और NIH से ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया. कुल बातचीत कोशिकाओं (बी) रोलिंग, दृढ़ता से पक्षपाती या (सी) transmigrating के रूप में लक्षण वर्णन किया गया. डेटा SEM के 3 और 5 के बीच प्रयोगों के मतलब से अधिक का प्रतिनिधित्व करते हैं. पैनल ए और सी में नियंत्रण और TNF के बीच का अंतर महत्वपूर्ण था (0.001 <पी).

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Discussion

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शोधकर्ताओं ने नियमित रूप से विभिन्न संवहनी बेड से endothelial कोशिकाओं का इस्तेमाल किया न्युट्रोफिल भर्ती और स्थानांतरगमन अध्ययन के. उदाहरणों में शामिल हैं, लेकिन, त्वचीय microvascular endothelial 12 कोशिकाओं, जिगर sinusoidal endothelial मानव नाल की शिरा 10 से 13 और कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं सीमित नहीं हैं. उनमें से HUVEC उनके अलगाव और उपलब्धता के रिश्तेदार आसानी के कारण व्यापक लोकप्रियता हासिल की. HUVEC इन विट्रो मॉडल प्रणाली है कि mimics के कई endothelial प्रक्रियाओं है कि vivo में होने में एक शक्तिशाली हैं. इस मॉडल प्रणाली आसंजन अणु और chemokines कई ल्युकोसैट उपवर्गों और कैसे इन प्रक्रियाओं को विनियमित रहे हैं सक्षम विस्तृत विश्लेषण की भर्ती में महत्वपूर्ण पहचान में सहायता प्राप्त है HUVEC साथ इन विट्रो काम में vivo अध्ययन में के लिए नींव का गठन किया है कि अंततः प्रदान की है. बेहतर समझ और मानव रोग के लिए 14 उपचार.

हम एक तेजी से और सरल विधि इन विट्रो एक ibidi प्रवाह कक्ष का उपयोग में न्युट्रोफिल भर्ती अध्ययन प्रस्तुत e_content इस पत्र में "> कक्ष के इस तरह के अन्य समानांतर थाली इस पत्रिका में 11 पहले वर्णित कक्षों में कई फायदे हैं. Ibidi कक्षों के बने होते हैं ऑप्टिकल कांच है कि चरण विपरीत छवियों के लिए इसके अलावा में फ्लोरोसेंट और डीआईसी के चित्र लेने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है के लिए इसी तरह की विशेषताओं के साथ एक बहुलक कि कक्षों कांच coverslips उपयोग के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग सक्षम हैं, लेकिन कांच पर endothelial कोशिकाओं से बढ़. आसंजन के रूप में एक चुनौती है इन कोशिकाओं की संपत्ति 15 गिलास सतहों पर काफी बदल Endothelial कोशिकाओं प्लास्टिक की सतह के लिए अच्छी तरह से पालन करें. लेकिन प्लास्टिक सतह पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्राप्त नहीं है. ibidi μ का उपयोग स्लाइड न केवल इन समस्याओं को समाप्त, लेकिन वे भी अन्य तरीकों की तुलना में बहुत कम नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है ये स्लाइड भी केवल मामूली modific साथ एक साथ समानांतर प्रयोगों सक्षमसमझना.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

सुश्री Lailey उसे तकनीकी सहायता के लिए, और मानव गर्भनाल प्रदान करने के लिए कैलगरी, एबी में तलहटी अस्पताल में 51 यूनिट हम डॉ. से पीना Colarusso और लाइव सेल इमेजिंग सुविधा इमेजिंग और छवि विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद. डा. केडी पटेल एक अलबर्टा innovates है: स्वास्थ्य समाधान वैज्ञानिक. यह काम एक ऑपरेटिंग स्वास्थ्य और अभिनव और अलबर्टा विज्ञान और अनुसंधान प्राधिकरण के लिए कनाडा फाउंडेशन से अनुसंधान उपकरण और बुनियादी सुविधाओं के अनुदान के लिए कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197
Cord buffer Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM) M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016
Ibidi chambers Ibidi 80606
TNF-α Prepro Tech 300-01A
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X

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References

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Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).More

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

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