Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

doi: 10.3791/4032 Published: August 8, 2012

Summary

Эта статья впервые была описана процедура выделения человеческих эндотелиальных клеток из пуповинной вены, а затем показывает, как использовать эти клетки для изучения нейтрофилов переселение в проточных условиях. При использовании низкого объемного расхода камеры изготовлен из полимера с оптических характеристик стекла, живая клетка флуоресцентных изображений редких клеточных популяций также возможно.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Выделение и обеспечение прав сосудистых эндотелиальных клеток

  1. 2-го уровня биологической безопасности процедуры должны быть использованы при работе с человеческой кровью и тканями. Используя ножницы перерезали шнур из плаценты, а затем внимательно изучить шнур для сгустков крови и повреждения, вызванные пережатие пуповины во время родов. Вырезать и выбросить эти части мозга.
  2. Подготовить свежий раствор коллагеназы в дозе 1 мг / мл при заливке 50 мл теплой буфер шнур в трубку, которая содержит 50 мг коллагеназы.
  3. Изменения в стерильных перчатках и открыть лоток автоклавного документ, содержащий стерилизовать тупой канюли, шнур зажимы, ножницы, трехходовой стоп-краны и марли в ламинарном боксе.
  4. Определить две артерии и одна вена в настоящий мозг. Артерии имеют меньшие размеры и, как правило, плотно суженные, в то время жила большая и легко вводить иглу. Чтобы очистить кровь из вены, аккуратно канюля с двусторонним кран прилагается к нему яНТО один конец вены и местом зажима вокруг канюли, чтобы держать это твердо в позиции. Заливать шнур буфера через вену. Повторяйте, пока поток через ясна, а затем зажать конец шнура.
  5. Заливать коллагеназы в вену, закройте кран, поставить шнур в стакан с теплой буфер мозга и инкубировать в течение 10 минут. Через 10 минут, снимите шнур и осторожно массировать шнур, чтобы ослабить эндотелиальных клеток из просвета вены. Слейте раствор в пробирку, содержащую клетки эндотелия СМИ (ECM). Промыть шнур буфера в два раза, чтобы удалить оставшиеся клетки. Слейте раствор в этой же трубы.
  6. Центрифуга клеток в 350 мкг в течение 10 минут в гранулах эндотелиальных клеток.
  7. Удалить супернатант и добавить 10 мл ECM в осадок. Осторожно ресуспендирования клеток в ECM, а затем перенести клетки T75 колбу предварительно покрытого 0,2% желатина. Предварительное покрытие с желатина было сделано, по крайней мере 1 час при 37 ° C. Рост клеток при 37 ° С и 5% CO 2.
  8. На следующий день, встряхните колбу выбить любые красные кровяные клетки удалите супернатант и промыть сбалансированный солевой раствор теплой Хэнка (HBSS). Удалить HBSS и кормить клеток по 10 мл теплой ECM. Изучить клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что красные кровяные клетки были удалены. Оцените степень слияния и морфологии клеток эндотелия. Эндотелиальных клеток на данном этапе должна быть вытянута без признаков вакуоли.
  9. Продолжайте менять средства массовой информации каждые три дня, пока клетки достигают слияния, а затем разделить клетки, используя 0.08% раствор трипсина содержащего 1 мМ ЭДТА. Пластина эндотелиальных клеток в нужном блюда предварительно покрытого 0,2% желатина. Клетки должны достичь слияния в 3-6 дней.
  10. При использовании ibidi камеры предварительного нанесения каждой камеры с 0,2% желатина. Удалите излишки желатина и фибронектина, а затем добавить 1,5 х 10 6 / мл эндотелиальных клеток, взвешенных в ECM в камеру. Изменение средств массовой информации каждый день, пока вonfluent. Клетки должны быть вырожденной в течение 2-3 дней в зависимости от питания.

2. Подготовка Нейтрофилы

  1. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здорового человека добровольцев использованием плотности центрифугирования. Подробный протокол с наглядной демонстрацией выделения нейтрофилов может быть найдено в предыдущем номере журнала 6. После изолированные, нейтрофилы ресуспендируют в концентрации 1х10 6 / мл в HBSS, содержащего 0,5% альбумина человека.

3. Настройка Ibidi палаты

  1. Рост клеток эндотелия в желатин покрытием камеры ibidi. Проверьте их каждый день, используя микроскопии фазового контраста, пока они не стали сильно вырожденным.
  2. Стимулирование эндотелиальных клеток увеличить экспрессию адгезии и активации молекул. Для целей настоящего Протокола, эндотелиальные клетки стимулировали 10 нг / мл рекомбинантного ФНО-α в течение четырех часов при температуре 37 ° С и 5% CO
  3. Подготовьте микроскоп, и шприцевой насос, как визуально описывается Визе и его коллеги 11 с использованием пустой камере ibidi.
  4. Основные различия между этим протоколом и Визе процедура включает предварительное заполнение трубы, чтобы предотвратить воздействие на эндотелиальные клетки в воздухе, сохраняя буфера при 37 ° C с помощью водяной бани, используя Pharmed трубку держать буфер от потери температуры и с использованием различных Цели на микроскопе в зависимости от изображения с фазового контраста и флуоресценции.
  5. После того, микроскоп устанавливается и трубки заполнена HBSS, закройте все краны и удалить пустые камеры ibidi.
  6. Подключите камеру ibidi содержащих TNF-α стимулировали эндотелиальных клеток в трубки.

4. Нейтрофилов найма и переселение

  1. Визуализируйте эндотелиальных монослоя клетки в microscОПЕ помощью 10x цель фазового контраста.
  2. Установить шприцевой насос снять и начать поток HBSS в желаемом напряжении сдвига (обычно от 0,5 до 2 дин / см 2).
  3. Со стороны входа, переход от HBSS в изолированных нейтрофилов (1х10 6 / мл) путем включения трехходового стоп-кран.
  4. Начало записи с помощью ПЗС-камеры подключены либо к записи DVD или подключается непосредственно к компьютеру. Запустите таймер, когда нейтрофилы войти в камеру. Заливать нейтрофилов в течение четырех минут. В общей сложности 3 мл нейтрофилов подвески достаточно для одного эксперимента.
  5. Через четыре минуты, вернуться к HBSS, чтобы предотвратить присоединение новых нейтрофилов. Если данные для общего взаимодействия, прокат и фирмы сцепление желательны, Изображение 6 случайных полей за 10 секунд, каждый из которых использует 10x цель фазового контраста между минуты 4 и 5.
  6. Переключитесь на 40x цель и записать одно поле зрения от 5 до 10 минут. На 10 минут, собратьмежду 5 и 10 случайных полей зрения.
  7. Остановить поток и перейти к следующей камере.

5. Флуоресцентные изображения в условиях кровотока Использование Ibidi палаты

  1. Этикетка как эндотелиальные клетки или нейтрофилов с флуоресцентный зонд интерес. Например, анти-VE-кадгерина антитела, конъюгированные с Alexa-[547] может быть использована для визуализации эндотелиальные клетки узлов.
  2. Соберите ibidi камеру на микроскопе с дифференциальными интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной возможности. Мы используем FluoView 1000 конфокальной (Olympus) с экологической палаты. Фокус использование цель предназначена для ДВС и люминесцентные работы.
  3. Получить одновременное ДВС и флуоресцентные изображения с помощью программного обеспечения, поставляемого продавцом в то время как в соответствии с временем Конечно, описанных в разделе 4.

6. Анализ нейтрофилов набор

  1. Анализ подвижного и взаимодействующих клеток описывается Визе и др. 11. Чтобы измерить процент нейтрофилов прокатки на эндотелиальных монослоя подсчета количества нейтрофилов, которые переехали более одной ячейки диаметром в течение 5 секунд. Разделите это число на общее число лейкоцитов в поле, чтобы определить процент подвижного клеток. В более широком смысле, остальные клетки считаются твердо приверженцем.
  2. Измерить скорость качения нейтрофилов путем вычисления расстояния нейтрофилов ездил в определенный период времени, а затем разделив его к тому времени в секундах.
  3. Переселение определяется путем подсчета количества нейтрофилов, которые изменили форму и мигрировали под монослой 10. Эти нейтрофилы определяются тем, что они меняются от того этапа, когда ярко поверх монослоя к тому, фаза темно, когда под монослой 10. Число клеток переселился может быть выражена в процентах от общего числа клеток в поле зрения или в качестве сырья онемениеэ переселился из клеток на единицу площади. В этой модели система, как правило, 50% нейтрофилов переселиться после 10 минут.

7. Представитель Результаты

Нестимулированных эндотелиальные клетки не поддерживают нейтрофилов найма. В отличие от этого, стимулируя эндотелиальные клетки с TNF-α приводит к нейтрофилов прокат, сцепление фирмы и переселение. Пример этих данных показано на рисунках 1 и 2. Рисунок 1А показывает нейтрофилов взаимодействия с TNF-α-стимулированных эндотелиальных клеток. Эти взаимодействия могут быть определены количественно, выявление общего числа нейтрофилов взаимодействия с эндотелиальных клеток, а также числа нейтрофилов прокат, твердо сторонником или переселены (рис. 2). Нейтрофилов переселение может произойти в клетке узлов или через эндотелиальные клетки сами. Чтобы различать эти два условия, эндотелиальные клетки помечены анти-VE-с adherin антител и переселение оценивается как происходящие paracellularly или transcellularly (рис. 1B и C). В этой модели, практически все это переселение трансклеточной 7.

Рисунок 1
Рисунок 1. Одновременное DIC и флуоресценции в проточных условиях использования камеры ibidi. (A) DIC изображение свежевыделенных нейтрофилов человека мигрирующих через пупочной вены человека эндотелиальных клеток. Желтая стрелка показывает сторонник нейтрофилов, белая стрелка показывает, переселяющимся нейтрофилов. (B) эндотелиальных переходы клетки окрашивали анти-VE-кадгерина антитела, конъюгированные с Alexa-[547] и образ. (C) показывает наложение каналов А и В, показывая, что практически все, переселяющимся в этой модели трансклеточной. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

_content "> Рисунок 2
Рисунок 2. Эндотелиальные клетки остались нестимулированных или стимулировали 10 нг / мл TNF-α. Через 4 часа, параллельно камере поток пластина была собрана и нейтрофилов перфузии по состоянию на 1 дин / см 2. (A) нейтрофилов взаимодействия были рассмотрены и измеряется с помощью программного обеспечения ImageJ от НИЗ. Общая клетки взаимодействующих были охарактеризованы как (B) прокат, твердо сторонником или (C) переселяющимся. Данные представляют собой средние + SEM от 3 до 5 экспериментов. Разница между контролем и TNF в панелях и C была значимой (р <0,001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Исследователи обычно используют эндотелиальных клеток из различных сосудистых кровати для изучения нейтрофилов найма и переселение. Примеры включают, но не ограничиваясь, кожных клеток эндотелия микрососудов 12, печени синусоидальных эндотелиальных клеток 13 и эндотелиальных клеток из пупочной вены человека 10. Среди них HUVEC приобрела широкую популярность из-за своей относительной простоты и доступности изоляции. HUVEC являются мощным в пробирке модель системы, которая имитирует многие эндотелиальных процессы, которые происходят в живом организме. Эта модель системы помогает в идентификации молекул адгезии и хемокинов решающее значение в наборе много лейкоцитов и подклассов включен подробный анализ того, как эти процессы регулируются. В лабораторных работ с HUVEC сформировал основу для прижизненного исследования, которые в конечном счете обеспечили лучшего понимания и лечения заболеваний человека 14.

e_content "> В этой статье мы представляем быстрый и простой способ для изучения нейтрофилов набор в пробирке использованием камеры ibidi потока. Такая камера имеет ряд преимуществ по сравнению с другими параллельных пластин описаны ранее в этом журнале 11. Ibidi камеры состоят из полимера с оптическим характеристикам похож на стекло, которая позволяет пользователю принять люминесцентных и DIC изображений в дополнение к фазового контраста изображения. Есть камеры, которые используют стекло покровные чтобы флуоресцентных изображений, но растущий эндотелиальных клеток на стекле является проблемой, поскольку адгезия Свойство этих клеток существенно измениться на стеклянных поверхностях 15. эндотелиальных клеток хорошо прилипают к пластиковой поверхности, но флуоресценции на пластиковой поверхности не достижимо. Использование μ ibidi скользит не только устраняет эти проблемы, но они требуют гораздо меньше объема образца, чем другие методы . Эти слайды также обеспечивает одновременную параллельную эксперименты с небольшими ModificЦ И А Ц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Пина Colarusso и Онлайн фонда изображений Сотовые за их помощь в визуализации и анализа изображений, г-жа Lailey ее технической помощи, а также блок 51 на Предгорья больница в Калгари, AB для обеспечения человеческой пуповины. Д-р К. Пател является Альберта инновационную: Health Solutions Scientist. Эта работа была поддержана грантом от операционной канадского института по научным исследованиям и оборудования и инфраструктуры, гранты от Канадского фонда инноваций и Альберта научно-исследовательский орган.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase Type 1 Worthington 4197
Cord buffer Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4
Endothelial Cell Media (ECM) M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml
M199 GIBCO 31100-035
Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) Invitrogen 10378-016
Ibidi chambers Ibidi 80606
TNF-α Prepro Tech 300-01A
Human Albumin 20% solution Gemini Bioproducts 800120050
HBSS without Ca2+ and Mg2+ Sigma H2487-10X
HBSS with Ca2+ and Mg2+ Sigma H1387-10X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  2. Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
  3. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  4. Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
  5. Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
  6. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  7. Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
  8. Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
  9. Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
  10. Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
  11. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  12. Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
  13. Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
  14. Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
  15. Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).More

Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032, doi:10.3791/4032 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter