Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

doi: 10.3791/4046 Published: June 27, 2012

Summary

Bisülfit mutagenez DNA metilasyon analizi için altın standarttır. Bizim modifiye protokolü tek hücre düzeyinde DNA metilasyon analizini sağlar ve özellikle bireysel oositler için tasarlanmıştır. Ayrıca, bölünme aşamalı embriyo için de kullanılabilir.

Abstract

Epigenetik tüm kalıtsal kapsar ve geri dönüşümlü değişiklikler dolayısıyla alter gen erişilebilirlik ve gen transkripsiyonu 1 düzenleyen birincil mekanizmaları olduğunu kromatine. DNA metilasyon baskıcı bir işareti olarak ağırlıklı olarak hareket eden bir epigenetik modifikasyon olduğunu. CpG dinucleotides in sitozinleri üzerine, bir metil grubu ile kovalent yanı boyunca, bu kromatin kondensasyon ve genler 2 susturulmasında süreçleri başlatmak için ek protein ve baskıcı histon modifikasyonları katabildikleri. Bu gelişimsel programlama, hücre farklılaşması, retroviral elemanlarının baskı, X kromozomu inaktivasyonu ve genomik imprinting kritik bir rol oynar gibi DNA metilasyon normal gelişimi için gereklidir.

DNA metilasyon analizi için en etkili yöntemlerinden biri bisülfit mutagenez olduğunu. Sodyum bisülfit uracils içine sitozinleri deaminates bir DNA mutajen olup. PCR ve seque ardından ncing, bu dönüşüm olaylar thymines olarak algılanır. Metillenmiş sitozinleri deaminasyon korumalıdır ve böylece kişi nükleotid 3. seviyede DNA metilasyon belirlenmesini sağlamaktadır sitozinleri olarak kalır. Bisülfit mutagenez testin geliştirilmesi başlangıçta daha duyarlı ve 7 tekrarlanabilir hangileri doğru 4-6 bildirdi olanlardan ilerlemiştir. Bir anahtar ilerleme böylece sert bisülfit tedavisi 8 DNA koruyan bir agaroz boncuk DNA az miktarda gömme edildi. Bu etkin metilasyon analizi oosit ve blastosist aşamasındaki embriyoların 9 havuzlarda yapılacak. Bugüne kadar en sofistike bisülfit mutagenez protokolü bireysel blastosist aşaması embriyo için 10 olduğunu. Blastokist ortalama 64 hücreleri (genomik DNA 120-720 pg içeren) üzerinde var Ancak, bu yöntem bireysel oosit veya klivaj aşamasındaki embryo metilasyon çalışmaları için etkili değildir.

çadır "> oosit dahil 11 dakikalık DNA miktarda agaroz gömme gelen ipuçları alarak, burada oosit doğrudan bir agaroz ve lizis çözüm boncuk hemen aşağıdaki alımı ve oosit den zona pellucida çıkarılması gömülü sayede bir yöntem sunuyoruz. Bu bize sağlar iki tek yumurta bisülfit mutagenez başlıca zorlukları aşmak:. bozulması DNA bir dakika miktarda korunması ve çok sayıda protokol adımları boyunca sonraki veri kaybını tek oosit elde edilir gibi önemlisi, havuzlar içinde PCR yanlılık sorunu ortadan kalkar Dahası. , birden fazla metilasyon desen ile herhangi bir örnek analizi 12 dışında tutulabilir yana istenmeyen cumulus hücre kirlenme. Bu metod ile tespit edilebilir Bu protokol, tek hücre düzeyinde DNA metilasyon başarılı bir şekilde ve tekrarlanabilir analizler için geliştirilmiş bir yöntem sağlar ve ideal olarak uygundur bireysel oositlerin yanı sıra klivaj dönemi embriyodan için.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. GÜN

Böyle GIBCO su gibi steril, distile su ile oosit toplama günü taze aşağıdaki çözümleri hazırlayın. DNA bulaşma olasılığını azaltmak için, çoğu zaman eldiven değiştirme ve filtre ipuçlarını kullanın. Zaman açık tüpler uzak açılı tutun ve kullanılmadığı zaman tüm tüpler recap. Biz çözümler n +1 olarak yapılır öneririz.

% 3 LMP Agaroz

30 mg Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz
1 ml GIBCO H 2 O
@ 70 çözülür ° C

Lizis Çözüm

8 ul lizis tamponu
1 ul proteinaz K
1 ul% 10 IGEPAL
kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde yer

02:01 Agaroz: Lysis Çözüm (bireysel oosit başına 10 ul, miktarı 3 oosit için)

20 ul% 3 LMP agaroz
10 ul Lizis Çözüm
@ 70 karıştırın ° C

SDS Lysis Tampon (bireysel oosit başına 501 ul)

1x TE pH 7.5 450 ul
% 10 SDS 50 ul
Proteinaz K 1 ul
501 ul

1. Yumurta Toplama

  1. M2 medyada disseke fare siyon hatası yerleştirin ve kümülüs hücre kompleksi ayıklamak için ampullae gözyaşı.
  2. 0.3 mg / M2 medya 30 ul açılan ml hyaluronidaz çözümü kullanarak kümülüs hücre kompleksinden oosit ayırın. Sadece uzun uzun pozlama onlara zarar verebileceği gibi, kümülüs hücreleri çıkarmak için alır gibi çözüm oosit tutun. Periyodik kümülüs hücreleri giderici M2 medya 30 ul açılan 3x oosit, yıkayın.
  3. Asidik tyrode çözümü kullanarak zona pellucida çıkarın. Bir 30 transfer daha sonra ilk çözüm biri 30 ul açılan oosit yerleştirin veul damla gibi birlikte yürütülen herhangi bir medya asit sulandırmak ve etkinliğini azaltacaktır. Sadece sürece uzun pozlama onlara zarar verebilir, zona kaldırmak için alır gibi çözüm oosit tutun. Not: insan zona pellucida fare daha asidik Tyrode çözeltisi ile muamele daha dirençli olduğu gibi asidik çözeltisi ya da Tyrode pronaz artan bir konsantrasyon, insan numuneler için kullanılabilir.
  4. Bir kez daha M2 medya 30 ul açılan oosit yıkayın.

2. Agaroz gömülmesi ve Lizis

  1. Agaroz gömme gerçekleştirmek için, bir 70 ° C heatblock üzerine lizis çözeltisi yerleştirin. Lizis çözüm: 2:1 agaroz üreten lizis çözümü için önceden ısıtılmış LMP agaroz ekleyin.
  2. Minimal M2 medyada temiz bir cam slayt üzerine tek bir yumurta koyun. Bir pipet içine lizis solüsyonu ve (mikroskop altında) yavaşça damla ile karışmasına izin cam slayt üzerine (~ 1 ul veya daha az) küçük bir miktar sınırdışı: agaroz 10 ul sürebiliral ortam. Yavaşça pipet içine oosit pick up ve boncuk bir küre oluşturur böylece 300 ul mineral yağ ile bir Eppendorf tüp içine tüm 10 ul koydu.
    Not: Bu işlem agaroz gibi oldukça hızlı bir şekilde yapılmalıdır donacaktır sıcaklığı az 5 ° C ile 70 ° C'nin altına düşerse
  3. 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tüpü. Lizis gerçekleştirmek için, 300 ul mineral yağ kaldırmak ve SDS lizis tampon 500 ul ekleyin. 50 ° C su banyosunda gece inkübe edin.
    Not: Lysis çözeltisi (Tablo 1), aynı zamanda, bu amaç için kullanılabilir.

2. GÜN

Bisülfit mutagenez gününde taze aşağıdaki çözümleri hazırlayın. DNA bulaşma olasılığını azaltmak için, çoğu zaman eldiven değiştirme ve filtre ipuçlarını kullanın. Zaman açık tüpler uzak açılı tutun ve kullanılmadığı zaman tüm tüpler recap. Biz çözümler n +1 olarak yapılır öneririz.

<20 ml otoklavlanmış GKD 2 O td> 2.4 g NaOH
3 M NaOH
0.1 M NaOH 14.5 ml otoklavlanmış GKD 2 O 3M 0.5 ml
0.3 M NaOH 13.5 ml otoklavlanmış GKD 2 O 3M 1.5 ml

2.5 M Bisülfit Çözüm

  1. 3.8 g sodyum bisülfit
    5.5 ml damıtılmış GIBCO H2O
    1 ml 3 M NaOH
    @ oda sıcaklığında çözülür
  2. 110 mg Hidrokinon
    1 ml damıtılmış GIBCO H2O
    @ 90 ° C (sadece sürece eritmek için alır gibi için, düzenli mix) çözülür

Tamamen çözündüğünde çözeltisi (a) karışımı ve (b)
* Işık * uzak tutun

3. Bisülfit Mutagenezi

  1. Tam 500 ul SDS lizis tamponu çıkarın ve 300 ul mineral yağ (~ 20 saat) ekleyin. Kalan herhangi bir lizis tamponu inci sulandırmak olure agaroz bu ısıtılır ve boncuk sonraki adımlarda eriterek daha duyarlı olacak zaman. Hemen bisülfit mutagenez ile devam edin, ya da 5 güne kadar -20 ° C'de saklayın.
  2. Varsa, dondurucudan oosit kaldırmak ve (agaroz boncuk nispeten saydam sadece kadar) çözülme sağlar. 10 dakika buz üzerinde hangi inkübe takiben, 90 ° C ısıya blok üzerinde 2.5 dakika inkübe.
    Not: karıştırmak veya karıştırın, daha uzun süre 2.5 dakika uzatmak, ya da sıcaklık dalgalanma etmeyin.
  3. Denatürasyon gerçekleştirmek için, mineral yağ çıkarmak ve her tüp, fiske 1 ml 0.1M NaOH ekleyin ve 5-6 kez ters çevirin.
  4. Ters bir 37 ° C su banyosunda 15 dakika, her 3-4 dakika inkübe edin. Boncuk NaOH içinde yüzer olmalıdır.
  5. Bisülfit tedavi gerçekleştirmek için hafifçe döndürün tüp, daha sonra NaOH kaldırmak ve 300 ul mineral yağ ve 500 ul bisülfit çözeltisi ekleyin. 50 ° C su banyosunda 3.5 saat boyunca tüp inkübe edin. * Işık * uzak tutun Not: inkübasyon süresi ampirik ilgi gen için belirlenen gerekebilir.
  6. Desulfonation gerçekleştirmek için, 3 dakika buz üzerinde inkübe, daha sonra, madeni yağ ve bisülfit çözüm kaldırmak hafifçe döndürün ve 1 ml 0.3 M NaOH ekleyin. Flick ve 5-6 kez ters çevirin.
  7. Ters bir 37 ° C su banyosunda 15 dakika, her 3-4 dakika inkübe edin. Boncuk NaOH içinde yüzer olmalıdır.
  8. Örnekleri yıkayın, önce yumuşak iplik tarafından, daha sonra NaOH kaldırmak ve 1 ml 1x TE pH 7.5 ekleyin. Oda sıcaklığında (bir çalkalayıcı) de 5-10 dakika boyunca sallayın. Tekrar yavaşça çevirin, daha sonra 1x TE kaldırın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlayın.
  9. 1 ml otoklav GKD 2 O. ekle Oda sıcaklığında (bir çalkalayıcı) de 5-10 dakika boyunca sallayın. Yavaşça Spin, daha sonra 2 H, O. kaldırmak Iki kez GKD 2 O yıkama tekrarlayın.
  10. Üstte kalan sıvı kısmın pH kontrol edilir; bu pH 5,0 olmalıdır. Hala çok temel varsa, H 2 O ile tekrar yıkayın Sadece agaroz olması bırakarak, tüm süpernatantıreklam.

4. 1. ve 2. Yuvarlak PCR

  1. ** Yıkarken 1. tur PCR karışımı hazırlayın **
Forward Outer 10 uM Astar 0.5 ul
Dış 10 uM Astar Ters 0.5 ul
240 ng / ml tRNA 1 ul
H2O 13 ul

Misal-Hazır git Sıcak Başlangıç ​​PCR boncuk ekle
Dikkatle PCR tüpü (~ 10 ul) içine katı agaroz boncuk kaydırın
70 ° C ve karıştırın Isı
25 ul mineral yağ ekleyin
Toplam: 50 ul

  1. Yükseltmek
    Not: Fare Snrpn için minimize eder bir örneği, 94 de 2 dakika süreyle 94 denatürasyon olup az 30 saniye 40 döngü izledi ° C, ° C, 50 ° C'de 1 dakika ile 168 dakikada ° C ve 68 azından bir nihai uzamaya 10 dakikalık bir adım ° C. 1. turda fare H19 için PCR ve Peg3 sıcaklık Tavlama 50 ° C'dir
  2. 2. turda PCR karışımı hazırlayın
İleri İç 10 uM Astar 0.5 ul
İç 10 uM Astar Ters 0.5 ul
H2O 19 ul

Misal-Hazır git Sıcak Başlangıç ​​PCR boncuk ekle
Bir şablon olarak 5 ul 1. Yuvarlak ürün ekleyin. ° C'de 1 dakika agaroz yumuşatmak için 70 1. turda ürün ısıtın. Mineral yağ tabakası altında Pipeti emin olun.
25 ul mineral yağ ekleyin
Toplam: 50 ul

Not: Snrpn, H19 ve Peg3 için iç içe primer dizilerinden Pazar-Velker ark 10 bulunabilir,12.

  1. Yükseltmek
    Not: BİSİKLET koşulları fare Snrpn için 94 de 2 dakika süreyle 94 ° denatürasyon az 30 saniye 40 döngü izledi C, ° C, 50 ° C'de 1 dakika ve 68 de 1 dakika ° C ve 10 dakikalık bir nihai uzamaya 68 de adım ° C'de 10. Fare H19 ve Peg3 gerektiren bir 50 ° C 2. tur PCR sıcaklık tavlama.
  2. Bir tanı testi olarak, ikinci turda örnekleri metilasyon veya suş spesifik bir restriksiyon enzimi ile kesilebilir.
2. Yuvarlak ürün 4 ul
Kısıtlama Enzim 1 ul
Tampon 1 ul
H2O 4 ul
  1. Bir 8% akrilamid jel üzerinde, sindirim ürünleri Electrophorese. Herhangi bir heterojen bantları, birden fazla seque temsilnce.

5.. TA Klonlama ve Colony PCR

  1. 2. yuvarlak ürün, 70 ilk ısı klonlamak için ° C 1 dakika Promega pGEM-T Vector Sistemi (Fisher Scientific Kedi # A1360) kullanarak vektör sonra içine ligate agaroz, yumuşatmak için.
2. Yuvarlak PCR 1 ul
pGEMT-KOLAY vektör 1 ul
Ligaz 1 ul
H2O 2 ul
2x Ligasyonu Tampon 5 ul

Gece @ 4 ° C PCR makinesi inkübe edin.

  1. 15 dakika buz üzerinde yetkili E.coli hücreleri (Zymo Research Corp Kedi # T3009) çözülmesini sağlayın. 8 ul E.coli ve 15 dakika buz üzerinde inkübe ligasyona 3 ul ligasyon reaksiyonu ekleyin.
  2. 42 ° C su banyosunda 40 saniye için ısı çarpması,ve 2 dakika buz üzerinde inkübe. 1 saat (sallama) için 37 ° C'de 60 ul SOC orta ve inkübe ekleyin.
  3. 37 ° C'da gece boyunca bir LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp plakası ve inkübe plaka üzerinde, reaksiyon karışımına tüm yerleştirin.
  4. Koloni PCR karışımı hazırlayın
20 uM M13 İleri Astar 0.7 ul
20 uM M13 Ters Astar 0.7 ul
5X Yeşil Go Taq Tampon 7.0 ul
10 mM dNTP 0.7 ul
Taq DNA polimeraz 0.28 ul
H2O 25.62 ul
35 ul toplam

Bir PCR tüpüne 35 ul Colony PCR master miks ekleyin. Bir pipet ve PCR reaksiyon içine girdap onunla plakadan beyaz bir bakteri kolonisi seçin.

  1. 94 de 10 dakika boyunca denatürasyon ile amplifiye ° 94, 45 saniye 30 döngü izledi C, 57 ° C'de, 30 saniye ° C ve 72 de 1 dakika ° C ve 72 azından bir nihai uzamaya 10 dakikalık bir adım ° C. % 1.5 agaroz jel üzerinde 4 ul Electrophorese. Sıralama için PCR ürün ~ 30 ul gönder.
    Not: oosit için 5 koloni PCR ürünleri dizilerek.
  2. Sıralama sonuçları elde edildikten sonra, metilasyonu okunabilir. Bir CG olarak kalmıştır herhangi bir orijinal CG metillenmiş ve şimdi bir TG herhangi bir orijinal CG unmethylated edildi.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bizim çalışmalarımızda, tahlil bireysel oosit ve embriyoların (Şekil 1) metilasyon basılır. Bisülfit dönüştürülür primerler kullanılarak iç içe PCR ardından, bir agaroz jel (Şekil 2) bir doğru parçası boyutu görselleştirerek başarılı bir dönüşüm onaylamak mümkün. Bir birey oositBir ebeveyn aleli temsil eder, ve teorik olarak, bir baskılı metilasyon paterni vardır. Bu nedenle, ikinci tur PCR ürünleri kasıtsız kontaminasyon için test edilebilir. DNA metilasyon (örneğin HinfI ya DpnII gibi) karşı duyarlı bir kısıtlayıcı enzim, bir metil veya unmethylated alel (Şekil 3) içermesi durumunda değerlendirmek için ikinci turda PCR ürünü sindirimi için kullanılabilir. T dönüştürülür bir unmethylated C artık enzimi tarafından tanınan ve kesilmemiş bir durumdayken enzim tanıma dizisi içinde bir metil C parçalanabilen edilir. Bu kümülüs hücre kontaminasyonu (Şekil 3) göstergesi olarak metillenmiş ve unmethylated allelleri hem içeren herhangi bir MII oosit örnek, atılmalıdır. Ligasyonu ve dönüşüm sonrasında, başarılı bir koloni PCR doğru ürün boyutu numunelerde (Şekil 4) sıralama için gönderilir sağlamak için bir jelde görüntülenebilmekte. Son olarak, beş ayrı cl sekansıBir MII oosit den olanlar beş aynı metilasyonu ve aynı nonCpG dönüşüm oranları (Şekil 5a) üretmelidir. Birden fazla desen içeren herhangi bir örneği (Şekil 5B) atılmalıdır. Ovulasyon MII oosit iki kromozom kopya veya ekli bir kutup bedene sahip olduğundan, benzer iki dizi paternleri (Şekil 5c) elde etmek için bir olasılık vardır. Biz kümülüs hücre kontaminasyonu ekarte edilemez yana oldukça farklı metilasyonu sahip oositler gelen verileri atarak öneririz.

Şekil 1
Şekil 1. Tek Oosit Bisülfit Mutagenez tahlil şematik.

Şekil 2
Bir şarkı gelen Snrpn için 2. turda amplifikasyon Şekil 2'de. Temsilcisi sonuçları% 1.5 agaroz jel le MII oosit. Lanes 1-4 dört tek MII oosit ve şeritli 5 negatif kontrol (oosit) 'dir. Snrpn Beklenen amplikon boyutu 420 bp olduğunu. L, merdiven.

Şekil 3
% 8'lik bir akrilamid jel üzerinde tek bir MII oosit den Snrpn için 2. turda metilasyon spesifik sınırlama sindirim gelen Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. HinfI tanı sınırlama sindirim (420bp, hat 1) kısıtlama sitesi yasaklayan bir T barındırıyor unmethylated DNA gösterir ya (kesim, 262, 103, ve 54 bp, şerit 2) tanıma site içinde bir C içerir metillenmiş DNA. Metillenmiş ve unmethylated hem restriksiyon enzimi siteleri (kesim ve kesilmemiş bantlar, şerit 3) gösteren Sindirim kümülüs hücre kontaminasyonu göstergesidir. L, merdiven.

Şekil 4
Şekil 4. Snrpn için koloni PCR Temsilcisi sonuçlar. Beklenen amplikon boyutu pGEM-T Kolay vektör Snrpn ligasyonu takip eden ve ileri M13 kullanarak ve geri primerleri 656 bp olduğunu. Lane 1-8, klonlar 1-8 dan amplikonlar. Clone 5 yanlış bir amplikon boyutu vardır ve sıralama için gönderilen edilmemelidir.

Şekil 5,
Şekil 5. Temsilcisi tek MII oosit den Snrpn sonuçları sıralama. Snrpn oositlerinde metillenmiş edilir. Siyah daireler metillenmiş CpG'ler göstermektedir. Beyaz çevreler unmethylated CpG'ler göstermektedir. CpG sayısı ve yerleşimi bir B6 suşu dişi fare temsilcisidir. a) Tek bir MII oosit den Snrpn sonuçları sıralama bekleniyordu. DNA Yalnızca tek bir iplikçik beş klon yükseltmek gerekir. Tek bir metilasyon paterni ve özdeş olmayan CpG dönüşüm pıtırtı ile oositn (non-larını yüzde dönüşüm toplam olmayan CpG sitozinleri bir yüzdesi olarak timin dönüştürülür non-CpG sitozinleri sayısı olarak hesaplandı sağa gösterilir) analizleri dahil edilmesi gerekmektedir. kümülüs hücre kontaminasyonu ile tek MII oosit den Snrpn b) Sıralama sonuçları. Birden iplikçik amplifikasyon belirten metilasyon devletler ve dönüşüm kalıpları arasındaki farklılık dikkat edin. c) kromozom kopya veya polar body dahil ikisi de tek bir MII oosit den Snrpn sonuçları Sıralama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu tek yumurta tahlil kritik ve özel bakım gerektiren bir dizi ile birçok adımları içerir. İlk oosit yıkanmasıdır. Mümkün olduğunca çok kümülüs hücreleri olarak kaldırmak için hiyalüronidaz tedaviyi takiben düşer taze ortamda her oosit birden çok kez yıkamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, zona pellucida kaldırılması için asidik tyrode çözümü için oosit aktarırken orta çevreleyen cumulus hücreleri temiz olduğundan emin olun. Oosit zona çıkarılmasını takiben çok yapışkan ve herhangi çevreleyen cumulus hücreleri kolayca oosit yapışmış olabilir. Bir zona-free oosit yapışmış bir kümülüs hücre çıkarmak çok zordur. Bu protokol daha sonra noktalarında kümülüs hücre kontaminasyon tespiti için olanak sağlarken, büyük olasılıkla atılır oositlerde tam protokol geçmesi, yapıcı, ne de ekonomik değildir.

İkinci önemli adım, oosit gömme olduğunu. Agaroz ve lys içinde oosit gömerken, bu düşük erime noktası (LMP) agaroz donacaktır 5 70 ° C'nin altında ° C gibi küçük sıcaklıklarda dikkat etmek önemlidir çözümdür Gibi, biz agaroz ve 70 lizis solüsyonu ° C karıştırma tavsiye ve sonra minimal orta cam slayt üzerinde bireysel oosit yerleştirerek. Bir kere hazır, pipet agaroz / lizis solüsyonu ve dikkatli henüz zamanında, mineral yağ altında hazırlanmış bir Eppendorf tüpüne oosit embed.

Bu proteinaz K ile ısı inaktivasyonu 2,5 dakika süreyle 90 ° C'de gerçekleştirilebilir olması kritik bir durumdur. Bu sapma tavsiye edilmez. Daha düşük sıcaklıklarda veya daha kısa sürelerde proteinaz K. inaktive olabilir yüksek sıcaklıklarda veya daha uzun süreleri, DNA'nın zarar verebilir

Bir hatırlatma olarak, sodyum bisülfit ve hidrokinon duyarlı hafiftir. Çözeltiler hazırlanır ve daha sonra folyo sarılmış olmalıdır, kehribar renkli ve / veya kullanım kadar bir karanlık çekmece yerleştirilir. Bisülfit çözeltisi t eklendikten sonra50 ° C'de inkübe zaman o tüp, tüp folyo veya karanlık kaplı çanta ile kaplanmış olmalıdır Biz aslında sıcak başlangıç ​​PCR boncuklar bulunan GE Healthcare tüm boş folyo çanta kullanın.

Son olarak, çoğu PCR gibi, biz zamanında her turda hazırlanması önerilir. Özellikle 70 ° C'de karıştırıldıktan sonra aşırı gecikmeler, amplifikasyon başarı oranını azaltacaktır.

Mevcut zamanda, protokolünün birey bir sınırlandırma oositler gelen dönüştürülmüş bisülfit DNA amplifikasyon başarı oranı% 40 den% 65 amplifiye gen fragmanının bağlı olarak değişmektedir olmasıdır. Ek sorun giderme bu oran artabilir de, bisülfit dönüşüm tedavisi çok uzun veya sert ve yeterli dönüşüm oranları (>% 85-90) sahip olmaması arasında bir trade-off var. Ikinci bir sınırlama henüz bisülfit mutagenez baskıcı 5-methylcytosine ve demetilasyon ara 5-hy ayırt edemezler13 droxymethylcytosine.

Çeşitli modifikasyonlar gen ya da ilgi bölgeye dayalı gerekebilir. Bisülfit dönüştürme süresi en düşük DNA hasarı ile en yüksek dönüşüm oranı optimizasyonu gerektirebilir. Biz bisülfit tedavi için 2,5 ila 4 saat aralığı (yarım saat aralıklarla) öneririz. Daha da iyileştirme dönüştürülür ilgi sekanslar (örneğin için PCR primer tasarımı içerebilir http://www.urogene.org/methprimer/ (Patterson, et al. yönelik parçasının uzunluğu ve CG muhtevasına dayalı) yanı sıra, PCR programların optimizasyonu ek bisülfit mutagenez iyileştirme seçenekleri 7). Bol astar-dimerleri ya klonlanmış olduğunda vektörünün içine entegre olacak spesifik olmayan amplikonlar yoksa, bir nihai modifikasyonu 2. yuvarlak PCR ürün olduğu jel çıkartma olup gerekli olabilir.

Biz daha önce bu göstermiştirprotokolünün birey MII oositler için 12 etkilidir. Ayrıca dönüştürülen DNA başarılı amplifikasyonu aynı oranları ile, farklı oosit çapları bir dizi büyüyor oositlerde verimliliğini test ettik. Önemlisi, tek bir hücre üzerinde metilasyon çalışmaları için etkin olmayan diğer bisülfit mutagenez prosedürleri göre, bu protokol bireysel oosit ve erken embriyo DNA metilasyon analizi sağlar. Bu germ hücreleri ve erken embriyo manipülasyonları ile ilgilidir özel olarak, üreme ve gelişim biyolojisi çalışmaları için önemlidir. Gelecek uygulamalar In vivo-türevi ve kültürlenmiş hücrelerde de dahil olmak üzere herhangi bir kökenli tek hücre, DNA metilasyonu analizi içerebilir. Ayrıca, elde edilecek ifade ve metilasyon veriler her iki sağlayan, DNA ve RNA aynı embriyo kurtarır bireysel blastosist testi geliştirdi. A gelecekteki uygulama singl değiştirerek içerecektire oosit tahlil ifade analizler için RNA gibi metilasyon testler için DNA kurtarmak için. Başka bir optimizasyon böylece kümülüs hücre kontaminasyon tespit izin, bir bedensel metillenmiş, yumurta-embriyo unmethyated geninde metilasyon tespiti için izin verecek El Hac ve ark 14 benzer aynı oosit için, çift yönlü testler, gerçekleştirmek olacaktır.

DNA metilasyon analizleri genom gelen odağı özgü arasında olabilir. Böyle metillenmiş DNA mikrodizilerinin ile birlikte immünopresipitasyon (MeDIP) veya ardışık olarak genom yöntemleri genellikle malzemenin bol miktarda gerektirir. Birleştirilebilir metilasyon spesifik kısıtlama enzimleri kullanılarak bisülfit restriksiyon analizi (COBRA), ya da MethylDetector kiti (Motif Aktif) içerir odağına spesifik yöntemler DNA, PCR önyargı ve eksikliği yetersiz geri kazanım sonuçlanan, tek blastosit analizler için daha az uygun olan daha tekrarlanabilirlik. Tek yumurta ve e alternatif bir yaklaşımbisülfit dönüştürülür DNA amplifikasyon bildirilen başarı oranları yöntemi burada açıklanan daha düşük olmasına rağmen ARLY embriyo metilasyon analizi tekniği 14 pyrosequencing sınırlı bir seyreltme bisülfit EZ-DNA metilasyon kiti (Zymo Araştırma) kullanılmıştır.

Bisülfit mutagenez DNA metilasyon analizi için altın standart olduğunu ve tek hücre analizi önemli bir adım olduğu açıktır. Agaroz gömme agaroz DNA bozulmaya karşı korur gibi, bisülfit tedavi ile analiz edilecek küçük örnek boyutu izin verir ve çok sayıda protokol adımları sırasında DNA kaybı önler. Bununla birlikte, blastosit ile karşılaştırıldığında, tek bir yumurta genomik DNA'nın yaklaşık 3-6 pg sahiptir. Agaroz içeren lizis tamponu tek oosit gömer Bizim modifiye protokol, ilk lizis adım ve ılımlılar sert bisülfit muameleye DNA kaybı başlangıcı engeller. Özet olarak, tek bir yumurta analiz avantajı olanak sağlamasıdıryanlışlıkla kümülüs hücre kontaminasyon tespit yanı nadir olaylar deşifre edip havuza örneklerinde herhangi bir PCR önyargıları ortadan kaldırarak. Toplamda, bu modifiye protokol bireysel oosit ve erken embriyo metilasyon durumu hakkında kaliteli veri sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Batı Ontario, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı Üniversitesi tarafından desteklenen ve Ministryof Araştırma ve Yenilikçilik, Erken Araştırmacı Ödülü bir hibe ER06-02-188. MMD Üreme, Erken Gelişim ve Sağlık (REDIH) Lisansüstü Bursu ile Etki bir CIHR Eğitim Programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oocyte Collection
Hyaluronidase Sigma H4272
Acidic Tyrode Sigma T1788
Proteinase K Sigma P5568
10% IGEPAL Bioshop NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7.5 Bioshop TRS001.5
LiCl Sigma L9650
EDTA pH 8.0 Sigma E5134
LiDS Bioshop LDS701.10
DTT Invitrogen P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7.5 Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) TRS001.5 E5134
10% SDS Bioshop SDS001.500
Bisulfite Conversion
Sodium Hydroxide Sigma S8045
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) Sigma 243973
Hydroquinone Sigma H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose Sigma A9414
Mineral Oil Sigma M8410
M2 Medium Sigma M7167
GIBCO Distilled water Invitrogen 15230-196
Autoclaved double distilled (dd) water
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG GE Healthcare 28-9006-54
240 ng/ml yeast tRNA Invitrogen 15401-011
Inner and outer nested primers Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector Fisher Scientific A1360
TA Cloning
Competent E.coli cells Zymo Research Corp. T3009
Equipment
Dissecting Microscope
70 °C and 90 °C Heat Blocks
37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations)
Rocker
PCR machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  2. Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
  3. Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
  4. Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
  5. Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
  6. Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
  7. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
  8. Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
  9. Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
  10. Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
  11. Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
  12. Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
  13. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  14. Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
Tek Oosit Bisülfit Mutagenez
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).More

Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter