Bisülfit mutagenez DNA metilasyon analizi için altın standarttır. Bizim modifiye protokolü tek hücre düzeyinde DNA metilasyon analizini sağlar ve özellikle bireysel oositler için tasarlanmıştır. Ayrıca, bölünme aşamalı embriyo için de kullanılabilir.
Epigenetik tüm kalıtsal kapsar ve geri dönüşümlü değişiklikler dolayısıyla alter gen erişilebilirlik ve gen transkripsiyonu 1 düzenleyen birincil mekanizmaları olduğunu kromatine. DNA metilasyon baskıcı bir işareti olarak ağırlıklı olarak hareket eden bir epigenetik modifikasyon olduğunu. CpG dinucleotides in sitozinleri üzerine, bir metil grubu ile kovalent yanı boyunca, bu kromatin kondensasyon ve genler 2 susturulmasında süreçleri başlatmak için ek protein ve baskıcı histon modifikasyonları katabildikleri. Bu gelişimsel programlama, hücre farklılaşması, retroviral elemanlarının baskı, X kromozomu inaktivasyonu ve genomik imprinting kritik bir rol oynar gibi DNA metilasyon normal gelişimi için gereklidir.
DNA metilasyon analizi için en etkili yöntemlerinden biri bisülfit mutagenez olduğunu. Sodyum bisülfit uracils içine sitozinleri deaminates bir DNA mutajen olup. PCR ve seque ardından ncing, bu dönüşüm olaylar thymines olarak algılanır. Metillenmiş sitozinleri deaminasyon korumalıdır ve böylece kişi nükleotid 3. seviyede DNA metilasyon belirlenmesini sağlamaktadır sitozinleri olarak kalır. Bisülfit mutagenez testin geliştirilmesi başlangıçta daha duyarlı ve 7 tekrarlanabilir hangileri doğru 4-6 bildirdi olanlardan ilerlemiştir. Bir anahtar ilerleme böylece sert bisülfit tedavisi 8 DNA koruyan bir agaroz boncuk DNA az miktarda gömme edildi. Bu etkin metilasyon analizi oosit ve blastosist aşamasındaki embriyoların 9 havuzlarda yapılacak. Bugüne kadar en sofistike bisülfit mutagenez protokolü bireysel blastosist aşaması embriyo için 10 olduğunu. Blastokist ortalama 64 hücreleri (genomik DNA 120-720 pg içeren) üzerinde var Ancak, bu yöntem bireysel oosit veya klivaj aşamasındaki embryo metilasyon çalışmaları için etkili değildir.
çadır "> oosit dahil 11 dakikalık DNA miktarda agaroz gömme gelen ipuçları alarak, burada oosit doğrudan bir agaroz ve lizis çözüm boncuk hemen aşağıdaki alımı ve oosit den zona pellucida çıkarılması gömülü sayede bir yöntem sunuyoruz. Bu bize sağlar iki tek yumurta bisülfit mutagenez başlıca zorlukları aşmak:. bozulması DNA bir dakika miktarda korunması ve çok sayıda protokol adımları boyunca sonraki veri kaybını tek oosit elde edilir gibi önemlisi, havuzlar içinde PCR yanlılık sorunu ortadan kalkar Dahası. , birden fazla metilasyon desen ile herhangi bir örnek analizi 12 dışında tutulabilir yana istenmeyen cumulus hücre kirlenme. Bu metod ile tespit edilebilir Bu protokol, tek hücre düzeyinde DNA metilasyon başarılı bir şekilde ve tekrarlanabilir analizler için geliştirilmiş bir yöntem sağlar ve ideal olarak uygundur bireysel oositlerin yanı sıra klivaj dönemi embriyodan için.Bu tek yumurta tahlil kritik ve özel bakım gerektiren bir dizi ile birçok adımları içerir. İlk oosit yıkanmasıdır. Mümkün olduğunca çok kümülüs hücreleri olarak kaldırmak için hiyalüronidaz tedaviyi takiben düşer taze ortamda her oosit birden çok kez yıkamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, zona pellucida kaldırılması için asidik tyrode çözümü için oosit aktarırken orta çevreleyen cumulus hücreleri temiz olduğundan emin olun. Oosit zona çıkarılmasını takiben çok yapışka…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Batı Ontario, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı Üniversitesi tarafından desteklenen ve Ministryof Araştırma ve Yenilikçilik, Erken Araştırmacı Ödülü bir hibe ER06-02-188. MMD Üreme, Erken Gelişim ve Sağlık (REDIH) Lisansüstü Bursu ile Etki bir CIHR Eğitim Programı tarafından desteklenmiştir.
Table of specific reagents and equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Oocyte Collection | |||
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
Proteinase K | Sigma | P5568 | |
10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
Lysis Solution | |||
Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
LiCl | Sigma | L9650 | |
EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
DTT | Invitrogen | P2325 | |
SDS Lysis Buffer | |||
TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
Bisulfite Conversion | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
M2 Medium | Sigma | M7167 | |
GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
Autoclaved double distilled (dd) water | |||
PCR | |||
Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
Inner and outer nested primers | Sigma | ||
Ligation | |||
Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
TA Cloning | |||
Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
Equipment | |||
Dissecting Microscope | |||
70°C and 90°C Heat Blocks | |||
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
Rocker | |||
PCR machine |