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गणना टोमोग्राफी निर्देशित कैंसर biomarkers का स्थानीयकरण के लिए समय डोमेन फैलाना छोटे जानवरों में प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी

Published: July 17, 2012 doi: 10.3791/4050
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1,2
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Physics and Astronomy, Dartmouth College, 3Darmouth Medical School, Dartmouth College, 4School of Computer Science, University of Birmingham

Summary

फैलाना प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी preclinical करने के लिए एक अपेक्षाकृत कम लागत और संभवतः उच्च भर दृष्टिकोण प्रदान करता है

Protocol

1. पशु तैयारी

  1. Ketamine xylazine (10 आईपी मिलीग्राम / किग्रा 100 मिलीग्राम / किग्रा) के भीतर और peritoneal इंजेक्शन के साथ नग्न माउस (चार्ल्स नदी, Wilmington, एमए) चतनाशून्य करना.
  2. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में जगह माउस, खोपड़ी में खोपड़ी की ओर से छोड़ दिया पर एक चीरा बनाने के लिए, एक 18 गेज सुई का उपयोग करने के लिए, एक केंद्रीय लाइन से 1 मिमी व्यास 2 मिमी खोपड़ी में छेद और पीछे 2 मिमी बना शीर्षस्थान.
  3. फॉस्फेट बफर समाधान के 5 μl में 5 × 5 10 U251 मानव neuronal glioblastoma कोशिकाओं (कृपया डार्टमाउथ कॉलेज, हनोवर, राष्ट्रीय राजमार्ग पर डॉ. मार्क इसराइल द्वारा) प्रदान की सतह के नीचे छोड़ दिया मस्तिष्क गोलार्द्ध में लगभग 2 मिमी की गहराई में इंजेक्षन मस्तिष्क. एक माइक्रो - सिरिंज हैमिल्टन 18 और कुंद प्रयोग सेल आरोपण के लिए 27 गेज सुई समाप्त हो गया और खोपड़ी की बाहरी सतह से सुई 3 मिमी की टिप डालने और फिर 1 कोशिकाओं के लिए एक जेब बनाने मिमी वापस लेने.
  4. सिवनी चीरा साइट और पुनः की अनुमतिसर्जरी से covery.
  5. ~ 14 दिनों के इंतजार के लिए इमेजिंग से पहले ट्यूमर विकसित करने की अनुमति है.

2. प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली अंशांकन

  1. माउस इमेजिंग के दिन पर, सिस्टम आरंभ और पराबैंगनीकिरण और प्रकाश का पता लगाने की अनुमति देने के लिए लगभग 20 मिनट के लिए गर्म - प्रणाली संवेदनशीलता में drifts से बचने के.
  2. प्लेस एक 100 ° द्वारा -4 ° इमेजिंग गैन्ट्री के प्रत्यक्ष केंद्र में इंजीनियर लाइन (Thorlabs, न्यूटन, न्यू जर्सी) diffusor, उत्तेजना लेजर सामान्य: एक picosecond स्पंदित 80 मेगाहर्ट्ज बहुपद्वति 635 एनएम लेजर (डायोड PicoQuant फोटोनिक्स उत्तर अमेरिका इंक, Westfield, एमए). Diffusor के कोण समायोजित करने के लिए सभी पांच प्रकाश संग्रह चैनलों से पता चला संकेत की राशि को अधिकतम करने के लिए. इमेजिंग ज्यामिति का एक पूर्ण विवरण 11,14,15 कहीं और प्रदान की जाती है.
  3. प्लेस 2 सब का पता लगाने प्रतिदीप्ति photomultiplier (पी एम टी) ट्यूबों और ओवर ड्राफ्ट 1 तटस्थ घनत्व फिल्टर के सामने (Thorlabs, न्यूटन, NJ) में तटस्थ घनत्व फिल्टर (गु आयुध डिपोorlabs, न्यूटन, न्यू जर्सी सभी संप्रेषण का पता लगाने PMTs के सामने). लेजर के 100 अस्थायी स्पंद प्रसार (TPSF) प्रोफाइल, 1 एस एकीकरण समय के साथ प्रत्येक ले लीजिए.
  4. लेजर संदर्भ द्वारा प्रत्येक TPSF मानक के अनुसार, लेजर संदर्भ में अस्थायी बहाव, और प्रत्येक डिटेक्टर के लिए सभी पुनरावृत्तियों से अधिक औसत के लिए सही है. इन औसत TPSFs के डिटेक्टर विशिष्ट साधन प्रतिक्रिया कार्य (IRF) ऑप्टिकल छवि के पुनर्निर्माण में इस्तेमाल कर रहे हैं.

3. इमेजिंग प्रोटोकॉल

  1. 2% ऑक्सीजन (1 एल / मिनट) में isoflurane के साथ माउस असंवेदनता उत्पन्न करना.
  2. फॉस्फेट बफर समाधान, intraperitoneally, 12 घंटे के 100 μl में 800CW के EGF IRDye के एक nanomole और एलेक्सा 647 Fluor 1 nanomole इमेजिंग के लिए पहले इंजेक्षन ट्यूमर में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर overexpression लक्ष्य.
  3. शीसे रेशा इमेजिंग बिस्तर का समर्थन करता है पर माउस रखें, माउस की व्यवस्था इतनी है कि अपनी नाक शंकु एक isoflurane संज्ञाहरण पहुंचाने में रहता है.
  4. Enसुनिश्चित करें कि कि माउस उचित बिस्तर पर तैनात किया जाता है: अर्थात्, कि जब बिस्तर प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली में सुरक्षित है माउस इमेजिंग गैन्ट्री के लगभग केंद्र में है. इस स्थिति उत्तेजना लेजर माउस के बारे में 180 डिग्री rotating, सुनिश्चित करना है कि लेजर का केन्द्र बिन्दु एक बिंदु लगभग सभी कोणों पर लेजर के नजरिए से माउस के केंद्र पर illuminates है द्वारा निर्देशित किया जा सकता है.
  5. एक बार तैनात, ध्यान (पर बिन्दुपथ, जीई हेल्थकेयर, लंदन, पता लगाने के) microCT स्कैनर इमेजिंग बिस्तर और माउस हस्तांतरण और माउस के पूरे सिर के लिए 93 माइक्रोन isotropic के एक प्रस्ताव पर संरचनात्मक जानकारी इकट्ठा.
  6. सीटी छवि ढेर कल्पना और टुकड़ा (ओं) प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली के साथ imaged किया जा चुनें.
  7. ध्यान से इमेजिंग बिस्तर और माउस प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली के लिए वापस हस्तांतरण. प्रत्येक इमेजिंग SLIC के लिए माउस के बारे में डेटा एकत्रित स्रोत पदों की संख्या चुनेंई (32), प्रत्येक TPSF (1) माप, प्रत्येक स्रोत (10) की स्थिति के लिए पुनरावृत्तियों की संख्या, और स्थिति और 3.6 कदम से सीटी छवि ढेर से वांछित इमेजिंग स्लाइस की संख्या के लिए एकीकरण का समय. कोष्ठकों में संख्या प्रत्येक इमेजिंग इमेजिंग टुकड़ा प्रति ~ डाटा अधिग्रहण के 5 मिनट उपज पैरामीटर के लिए विशिष्ट मान रहे हैं.
  8. (Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन, फॉल्स, VT धौंकनी) प्रतिदीप्ति पता लगाने PMTs के सामने तीन पायदान फिल्टर, प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों तक पहुँचने से किसी भी लेजर प्रकाश सीमित करने के लिए, और आयुध डिपो 2 संप्रेषण का पता लगाने PMTs के सामने तटस्थ घनत्व फिल्टर प्लेस संतृप्ति से बचने उन डिटेक्टरों की.
  9. डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाने के लिए, प्रत्येक परिभाषित स्रोत डिटेक्टर स्थिति में और प्रत्येक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (635 एनएम और 755 एनएम एलेक्सा से Fluor 647 और IRDye 800CW EGF tracers क्रमशः उत्तेजित) के लिए प्रतिदीप्ति और संप्रेषण TPSFs के एकत्रित. TPSFs एकत्र की हर सेट के लिए निगरानी और लेजर तीव्रता रिकॉर्डएक संदर्भ PMT चैनल के साथ.

4. छवि पुनर्निर्माण

  1. माउस की बाहरी सतह और सीटी छवियों से इमेजिंग बिस्तर समर्थन छड़ का स्थान निर्धारित और मास्क है कि माउस और इमेजिंग छड़ की सीमीत अलग से शामिल किया गया बनाने के.
  2. NIRFAST 19 सॉफ्टवेयर का उपयोग पशुओं के एक परिमित तत्व मेष उत्पादन माउस मुखौटा का प्रयोग करें.
  3. MicroCT और प्रतिदीप्ति स्थानिक पंजीकरण 20 सह तालमेल के आधार पर जाल की सतह पर प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली से स्रोत और डिटेक्टर पदों के स्थानीयकरण का.
  4. ऑप्टिकल डेटा स्रोत या डिटेक्टर पदों कि इमेजिंग बिस्तर समर्थन छड़ के स्थान के साथ बातचीत के साथ जुड़े अंक निकालें.
  5. प्रत्येक स्रोत डिटेक्टर स्थिति में लेजर संदर्भ द्वारा एकत्र डेटा, लेजर संदर्भ में अस्थायी बहाव के लिए सही है, और फिल्टर की संवेदनशीलता के लिए सही है, जो प्रायोगिक परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया है सामान्यकरें 15 खरीद के समय पर.
  6. प्रत्येक स्रोत डिटेक्टर स्थिति के लिए डेटा का जन्म अनुपात (प्रतिदीप्ति संप्रेषण से विभाजित) ले लो और संप्रेषण की आगे वर्दी ऑप्टिकल गुण के लिए परिमित तत्व पशु जाल पर आधारित सिमुलेशन मॉडल के साथ गुणा. यह स्रोत या डिटेक्टर ऊतक 21 युग्मन के साथ जुड़े त्रुटियों को कम करने के लिए, 22 मॉडल के लिए डेटा को जांचना, और मॉडल डेटा 23,24 बेमेल के अन्य पहलुओं के लिए डेटा को समायोजित करने के लिए किया जाता है.
  7. एक डेटा जन्म अनुपात दोनों तरंगदैर्य पर एकत्र डेटा के आकार अंतर से बना वेक्टर का निर्माण. स्केलिंग कारक के EGFR बाध्यकारी विपरीत अधिकतम करने के लिए चुना है. छवि के पुनर्निर्माण के समय डोमेन कैलिब्रेटेड एक निवेश के रूप में प्रत्येक पता लगाने के चैनल के लिए अंतर TPSF का उपयोग कर डेटा के साथ प्रदर्शन, और इसके विपरीत बढ़ाकर लक्षित 15 दरियाफ्त की प्रतिदीप्ति नक्शे बनाने के लिए.

5. प्रतिनिधि परिणाम

"> एक प्रतिदीप्ति एक में U251 orthotopic glioma ट्यूमर चित्रा 1b में प्रस्तुत किया है के साथ एक माउस के सिर से एक सह पंजीकृत सीटी शारीरिक छवि के साथ मढ़ा पुनर्निर्माण का एक उदाहरण है. फ्लोरोसेंट पुनर्निर्माण (चित्रा 1b द्वारा निर्धारित glioma का द्रव्यमान का केंद्र ) द्रव्यमान का ट्यूमर केंद्र के विपरीत - बढ़ाने के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (चित्रा 1 क) द्वारा निर्धारित की 1 मिमी के भीतर सीटी और एमआरआई छवियों सह पंजीकृत एक पारस्परिक जानकारी परिवर्तन पर आधारित थे.

चित्रा 1
चित्रा 1 (gadolinium) इसके विपरीत बढ़ाकर माउस सिर के चुंबकीय अनुनाद छवि (क). यह माउस orthotopically U251 मानव glioma सेल लाइन के साथ inoculated किया गया था. ट्यूमर के स्थान, जो सामान्य मस्तिष्क की तुलना में अधिक विपरीत एजेंट को अवशोषित छोड़ दिया मस्तिष्क गोलार्द्ध (सही छवि में) में देखा जा सकता है और सफेद तीर द्वारा संकेत. correspondinजी गणना टोमोग्राफी छवि (माउस सिर पर एक ही स्थान से) (ख) के साथ epidermal वृद्धि कारक प्रतिदीप्ति ऋण अलक्षित प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण मढ़ा लक्षित में दिखाया गया है. प्रतिदीप्ति की इकाइयों उलटा मिमी में हैं और बाध्य लक्षित अपनी क्षमता क्वांटम और अपनी एकाग्रता से गुणा प्रतिदीप्ति का अवशोषण गुणांक के लिए संबंधित.

Discussion

प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी (एफटी) एक संवेदनशील, विकिरण मुक्त आणविक इमेजिंग जैविक ऊतक के माध्यम से दिखाई और लगभग अवरक्त प्रकाश परिवहन पर आधारित साधन है. एफटी में ब्याज की अधिकांश छोटे पशु प्रयोगात्मक 1 मॉडल और एक शोध के प्रमुख क्षेत्र कैंसर biomarker अभिव्यक्ति और आणविक 26 उपचार के लिए प्रतिक्रिया का अध्ययन किया गया है में दवाओं की खोज और विकास में तेजी लाने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया गया. वर्तमान में, वहाँ दो एफटी प्रणाली डिजाइन करने के लिए प्रतिस्पर्धा दृष्टिकोण हैं. सबसे आम डिजाइन ठंडा प्रतिदीप्ति 4-9 पता लगाने के लिए प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरों पर आधारित है. इस डिजाइन माप की एक उच्च घनत्व प्रदान करता है, सीसीडी कैमरे में प्रत्येक पिक्सेल के बाद से ऊतक के नमूने अधिकतम प्रकाश है कि ऊतक के माध्यम से कूच किया है एक अद्वितीय पथ का पता लगा सकते हैं. हालांकि, सीसीडी कैमरों एक सीमित गतिशील रेंज है और पढ़ने के बाहर शोर उनके परम संवेदनशीलता की सीमा. दूसरा डिजाइन संभावित limita से बचा जाता है सीसीडी कैमरे का पता लगाने के अति संवेदनशील एकल फोटोन गिनती photomultiplier ट्यूबों या हिमस्खलन photodiodes 10-13 जैसे डिटेक्टरों के उपयोग पर आधारित प्रौद्योगिकी को रोजगार से माहौल. इन अधिक संवेदनशील तरीकों का पता लगाने का दोष यह है कि प्रत्येक डिटेक्तार केवल एक ही बिंदु पर प्रकाश इकट्ठा कर सकते हैं, इसलिए, घने ऊतक के नमूने प्राप्त करने के लिए, या तो कई डिटेक्टरों (जो बहुत महंगा है) इस्तेमाल किया जा है, या कई अनुमानों imaged किया जा साथ ही डिटेक्टर (जो काफ़ी समय हो सकता है). जबकि छोटे जानवर एफटी के लिए ऊतक के नमूने का इष्टतम स्तर पर नहीं सहमत हो गया है, और एक मामले दर मामले के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, इस बात पर सहमति है कि एकल फोटॉन गिनती उपकरण बेहतर करने के लिए संदर्भ में एफटी की संवेदनशीलता सीमा का पता लगाने के लिए अनुकूल है इसके लिए आणविक मार्करों के कम सांद्रता का पता लगाने की क्षमता की. इस अध्ययन में, हम बाहर ले जाने एफटी एकल फोटॉन गिनती का पता लगाने के उपकरण का उपयोग करने के लिए चूहों में ट्यूमर स्थानीयकरण के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं.

"ईएनटी> वहाँ चार महत्वपूर्ण कदम समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती एफटी के साथ मजबूत डेटासेट का उत्पादन करने के लिए शामिल हैं. पहले एक उपयुक्त और सरल अंशांकन प्रक्रिया के आवेदन है. प्रस्तुत पद्धति में प्रत्येक पहचान चैनल के संबंधित संवेदनशीलता जिम्मेदार हैं उत्तेजना के लिए प्रत्येक 15 डिटेक्टर करने के लिए प्रकाश के समान भिन्न प्रत्यक्ष लाइन diffusor के माध्यम से प्रेषित प्रकाश की एक आधारभूत माप इकट्ठा करके इसके अलावा, एक प्रयोग के दौरान पता चला प्रकाश लगातार लेजर संदर्भ के लिए calibrated है, और दोनों तीव्रता के संदर्भ में मतलब . समय है, जो समय के साथ लेजर संदर्भ 11,15 चैनल के संचालन से उतार चढ़ाव हो सकता है, दूसरा महत्वपूर्ण कदम सही और निर्देशित प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए संरचनात्मक इमेजिंग की सह पंजीकरण संग्रह है एफटी डेटा अकेले कोई संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है. इसलिए, क्रम में प्रकाश परिवहन की एक मॉडल बनाने के लिए कि लो फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैनमूना की सतह पर पाया प्रतिदीप्ति से एक नमूना के भीतर फ्लोरोसेंट स्रोतों के कटियन, एफटी प्रणाली के संबंध में नमूना की शारीरिक रचना सही जाना चाहिए. हमारी प्रणाली में संरचनात्मक जानकारी स्थानिक निर्देशांक कि स्थानिक एफटी 15,20 प्रणाली की उन के साथ पंजीकृत किया गया है के साथ एक माइक्रो - गणना टोमोग्राफी प्रणाली के द्वारा प्राप्त किया जाता है. तीसरा महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि एक इष्टतम प्रदर्शन (यानी, कुल फोटान का पता लगाने के समय प्रत्येक लेजर प्रक्षेपण के लिए) स्रोत डिटेक्टर हर स्थिति में कार्यरत है शामिल है. यह दो कारणों से महत्वपूर्ण है: पहला, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक का पता लगाने की स्थिति में संकेत करने के लिए पर्याप्त शोर और दूसरे के लिए डिटेक्टर संतृप्ति है, जो पता लगाने इकाइयों को नुकसान पहुंचा सकता है से बचने के है. आदेश में प्रत्येक डिटेक्टर स्थिति में इष्टतम जोखिम को प्राप्त करने के लिए, एक स्वत: जोखिम नियंत्रण में कार्यरत है, जो अनिवार्य रूप से दो, कम संकेत जोखिम 14 से इष्टतम प्रदर्शन triangulates. 4 महत्वपूर्णपद्धति का कदम प्रेषित उत्तेजना प्रकाश की मात्रा में एकत्र प्रतिदीप्ति डेटा को संदर्भित है. यह संदर्भित जन्मे अनुपात अक्सर कहा जाता है, और मुख्य मॉडल डेटा बेमेल त्रुटियों 23,24 शमन जा रहा है एक के साथ एफटी के लिए कई लाभ प्रदान करता है. प्रस्तुत प्रणाली के लिए 2 अलग photomultiplier ट्यूबों में प्रत्येक का पता लगाने के चैनल में प्रकाश channeling द्वारा दोनों प्रतिदीप्ति और प्रेषित उत्तेजना प्रकाश एक साथ पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था. ऐसा करने से, हम जन्मे अनुपात की सटीकता पर गति के प्रभाव से बचने के.

एक मजबूत डाटासेट यह हाथ के साथ, समय - डोमेन डेटा की छवि के पुनर्निर्माण परिमित तत्व अभिव्यक्ति होने के जाल के व्युत्क्रम समस्या को हल करना शामिल है:

घ = JX

जम्मू एक n x मीटर है, पता स्रोत डिटेक्टर अनुमानों मीटर और TPSF से समय फाटकों के लिए n एक्स मीटर तत्वों के साथ एक सदिश हैएल (या Jacobian) के संवेदनशीलता मैट्रिक्स, जाल में मैं नोड्स के लिए, और एक्स प्रत्येक नोड में प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल संपत्तियों की वेक्टर आकार एल डी है कैलिब्रेटेड प्रयोग और जम्मू के दौरान एकत्र डेटा नकली है परिमित तत्व समाधान का उपयोग है. प्रतिदीप्ति 25 परिवहन के समय डोमेन प्रसार सन्निकटन. डिटेक्टर विशिष्ट साधन प्रतिक्रिया के कार्यों के साथ जम्मू के समय आयाम भी है convolved एक्स ब्याज की प्रतिदीप्ति नक्शे के एक प्रतिनिधित्व है और Tikhonov नियमितीकरण के साथ 15 Levenberg - Marqardt गैर नकारात्मक कम से कम वर्गों दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए हल है.

कार्यप्रणाली यहाँ प्रस्तुत है, जो एक अत्यधिक संवेदनशील गिनती फोटॉन प्रतिदीप्ति का पता लगाने का उपयोग करते हुए चूहों में ट्यूमर स्थानीयकृत fluorescently लेबल में सक्षम प्रक्रिया का वर्णन, एफटी की सीमा बढ़ाने की क्षमता है. पिछले एक अध्ययन में, की क्षमता को रोजगारदृष्टिकोण से बड़े चूहों चूहों, साथ ही साथ माउस आकार के नमूनों में मौजूदा प्रणाली डिजाइन पर सुधार संवेदनशीलता जैसे जानवरों मॉडल, में, 17 प्रदर्शन किया गया. इस दृष्टिकोण की तत्काल आवेदन biomarker अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए एक उच्च throughput साधन में दवा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन छोटे पशु ट्यूमर मॉडल में vivo में होगा. प्रणाली की क्षमता को उत्तेजित और कई तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के कई फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ - साथ पता लगाने की अनुमति देता है. अतिरिक्त फ्लोरोसेंट मार्करों एक विकृति के कई पहलुओं से पूछताछ, एक साथ, या, जैसा कि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता का एक साधन प्रदान करते हैं, vivo में बाध्यकारी क्षमता को मापने के दोहरे संवाददाता तरीकों, रिसेप्टर घनत्व के एक मार्कर के रूप में अधिक मात्रात्मक इमेजिंग दृष्टिकोण को रोजगार 26,27.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान R01 CA120368 अनुदान, CA109558 R01 (KMT, वर्षा जल संग्रहण, FEG, BWP), RO1 (एम.जे., BWP) CA132750 और CA138578 K25 (FL) द्वारा वित्त पोषित किया गया है, और स्वास्थ्य अनुसंधान postdoctoral फैलोशिप पुरस्कार के कनाडाई संस्थानों (KMT ). प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली का विकास आंशिक रूप से एडवांस्ड रिसर्च टेक्नोलॉजीज (मॉन्ट्रियल, QC) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 800CW-EGF LI-COR Biosciences 926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester Life Technologies A20106 Reacted with water to minimize non-specific binding

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References

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