טומוגרפיה ממוחשבת מונחה תחום בזמן מפוזר טומוגרפיה זוהר על בעלי חיים קטנים על לוקליזציה של סמנים לסרטן

Summary

טומוגרפיה הקרינה מפוזר מציע גישה בעלות נמוכה יחסית ואפשרות גבוהה ברחבי כדי קליני

Abstract

בעלי חיים קטנים הקרינה הדמיה מולקולרית (FMI) יכול להיות כלי רב עוצמה לגילוי סמים קליני ומחקרי הפיתוח ^1. עם זאת, קליטת האור על ידי chromophores רקמות (למשל, המוגלובין, מים, שומנים, מלנין) בדרך כלל מגביל את התפשטות אותות אופטיים דרך עובי גדול יותר מאשר כמה מילימטרים ^2. לעומת באור הנראה אחרים, קליטה של ​​רקמות אדום קרוב אינפרא אדום (IR הקרוב) אור הקליטה יורדת בצורה דרמטית ולא אלסטי פיזור הופך את מנגנון דומיננטי אור רקמות אינטראקציה. התפתחות חדשה יחסית של סוכנים ניאון לקלוט פולטים אור בטווח הקרוב IR (600-1000 ננומטר), העלתה את הפיתוח של מערכות הדמיה ריבוי דגמים קלים שיכולים להשיג כל הגוף הדמיה תלת ממדית של חיות קטנות ^3.

למרות צעדים גדולים בתחום זה, הטבע חולה הנשקף של טומוגרפיה הקרינה מפוזר נשאר משמעותיבעיה של יציבות, התאוששות לעומת זאת ברזולוציה מרחבית של שיקום טכניקות התמונה ואת הגישה אופטימלי FMI אצל בעלי חיים קטנים עדיין לא הסכימו על. רוב קבוצות המחקר השקיעו במכשיר תשלום מצמידים (CCD) המבוססות על מערכות המספקות רגישות רקמות הדגימה אבל הכי מוצלח שופע ^4-9, בעוד הקבוצה שלנו ועוד כמה ^10-13 רדפו מערכות המבוססת על גלאי רגישות גבוהה מאוד , כי בשלב זה לאפשר דגימה רקמה צפופה כדי להיות מושגת רק במחיר של תפוקה נמוכה הדמיה. כאן אנחנו מראים את המתודולוגיה ליישום יחיד פוטון טכנולוגיית זיהוי במערכת טומוגרפיה הקרינה למקם נגע סרטני במוח במודל של עכברים.

הקרינה טומוגרפיה (FT) מערכת המועסקים פוטון יחיד לספור באמצעות צינורות מכפיל (PMT) ומידע עשיר תחום בזמן גילוי אור קונפורמציה ללא מגע ^11. זה מספק col בו זמניתlection של עירור מועבר אור פליטה, וכולל חשיפה אוטומטית הקרינה עירור השליטה ^14, התייחסות לייזר, ושיתוף אחת עם מערכת ממוחשבת חיים קטן (microCT) טומוגרפיה ^15. במודל של עכברים בעירום שימש הדמיה. חיים היה מחוסן orthotopically עם קו התא האנושי glioma (U251) בחצי הכדור המוח השמאלי צילמו 2 שבועות מאוחר יותר. הגידול נעשה על ידי הזרקת לזרוח נותב ניאון, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, לינקולן, NE) ממוקד לקולטן גורם הגדילה באפידרמיס, קרום התא חלבון ידוע כי ביטוי יתר בקו U251 גידול וסוגי סרטן רבים אחרים ^18. 2, נותב ניאון לא ממוקדים, Alexa פלואוריד 647 (Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק) הוזרק גם לתת דין וחשבון על הקולטן ללא תופעות בתיווך תפיסה של קליעים נותבים ממוקדות על מנת לספק אמצעי לכימות מחייב מעקב ו הקולטן זמינות / צפיפות ^27. CT-מודרך, לאIME תחומים האלגוריתם נעשה שימוש כדי לשחזר את המיקום של שני קליעים נותבים ניאון (כלומר, המיקום של הגידול) במוח העכבר יכולתם למקם את הגידול אומתה על ידי הדמיה ניגודיות משופרת באמצעות תהודה מגנטית.

הפגינו אף על דימות פלואורסצנטי במודל של עכברים glioma, המתודולוגיה הציג בסרט הזה ניתן להרחיב מודלים גידול שונים במגוון מודלים בבעלי חיים קטנים פוטנציאלי של עד לגודל של חולדה ^17.

Protocol

1. בעלי חיים הכנה

1. להרדים העכבר בעירום (Charles River, ווילמינגטון, MA) עם הזרקה תוך הצפק של קטמין, xylazine (100 מ"ג / ק"ג: 10 מ"ג / ק"ג IP).
2. העכבר במקום במסגרת stereotactic, לבצע חתך לתוך הקרקפת בצד השמאלי של הגולגולת, באמצעות מחט 18-מד, צור 1 מ"מ בקוטר מ"מ חור בגולגולת 2 מהקו המרכזי 2 מ"מ מאחור גבחת.
3. להזריק 5 × 10 ⁵ U251 תאים אנושיים גליובלסטומה העצבית (בתנאי חביב ב Dartmouth College, האנובר, NH על ידי ד"ר מרק ישראל) ב μl 5 של פתרון חיץ פוספט לתוך האונה השמאלית של המוח, בעומק של כ 2 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח. השתמש המילטון מיקרו מזרק ¹⁸ ו בוטה הסתיים 27-מחט מד להשתלה תא והכנס את קצה המחט 3 מ"מ מפני השטח החיצוני של הגולגולת, ואז לסגת 1 מ"מ ליצירת כיס עבור התאים.
4. החתך תפר האתר ולאפשר מחדשcovery מניתוח.
5. חכו ~ 14 ימים כדי לאפשר גידול לגדול לפני הדמיה.

2. כיול הקרינה טומוגרפיה מערכת

1. ביום הדמיה העכבר, ליזום המערכת ולאפשר לייזרים גלאי אור כדי חימום כ 20 דקות, כדי למנוע סחף של רגישות המערכת.
2. הנח 100 °-by-4 ° קו diffusor מהונדסים (Thorlabs, ניוטון, ניו ג'רזי) במרכז ישירה של gantry הדמיה, נורמלי לייזר עירור: picosecond פעמו-80-MHz לייזר multimode 635 ננומטר דיודה (PicoQuant Photonics צפון אמריקה בע"מ, ווסטפילד, MA). כוון את הזווית של diffusor כדי למקסם את כמות האות זוהה על ידי כל חמשת הערוצים איסוף אור. תיאור מלא של הגיאומטריה הדמיה מסופק במקום אחר ^11,14,15.
3. מניחים OD 2 מסנני צפיפות ניטרלי (Thorlabs, ניוטון, ניו ג'רזי) מול מכפיל את כל צינורות גילוי הקרינה (PMT) ו OD 1 מסנני צפיפות ניטרלי (ה 'orlabs, ניוטון, ניו ג'רזי) מול כל PMTs זיהוי העברה. איסוף 100 הזמני התפשטות הדופק פרופילים (TPSF) של לייזר, כל אחד עם הזמן 1-s אינטגרציה.
4. לנרמל את כל TPSF בהתייחס לייזר, המתאים להיסחף הזמני בהפניה לייזר, בממוצע על פני כל חזרות עבור כל גלאי. אלה TPSFs ממוצעים הם גלאי ספציפיים תגובה מכשיר פונקציות (IRF) המשמשים לשחזור תמונה אופטי.

3. הדמיה פרוטוקול

1. להרדים את העכבר עם 2% isoflurane חמצן (1 ליטר / דקה).
2. להזריק 1 nanomole של IRDye 800CW-EGF ו 1 nanomole של Alexa פלואוריד 647 ב 100 μl של פתרון פוספט חיץ, intraperitoneally, 12 שעות לפני הדמיה למקד הצמיחה אפידרמיס גורם ביטוי יתר לקולטן בגידול.
3. מניחים את העכבר על גבי פיברגלס תומך המיטה הדמיה, הסדרת העכבר כך אפו נשאר חרוט מתן הרדמה isoflurane.
4. עיןבטוח העכבר ממוקם כראוי על המיטה: כלומר, שכאשר המיטה מאובטחת למערכת טומוגרפיה הקרינה העכבר הוא במרכז המשוער של gantry הדמיה. מיקום זה יכול להיות מונחה על ידי החלפה של לייזר עירור 180 ° על העכבר, להבטיח כי מוקד לייזר מאירה נקודה בערך במרכז של העכבר מנקודת המבט של לייזר על הזוויות.
5. בעמדה אחת, בזהירות להעביר את המיטה הדמיה העכבר כדי microCT (לוקוס לחקור, GE Healthcare, לונדון, ב) סורק ולאסוף מידע אנטומי ברזולוציה של איזוטרופיים 93-מיקרומטר עבור ראש שלם של העכבר.
6. דמיינו את ערימת התמונה CT ולבחור את הפרוסה (ים) להיות צילמו עם מערכת טומוגרפיה פלואורסצנטי.
7. בזהירות להעביר את המיטה הדמיה העכבר חזרה למערכת טומוגרפיה פלואורסצנטי. בחר את מספר עמדות מקור לאסוף נתונים על העכבר עבור כל אחד SLIC הדמיהדואר (32), הפעם בשילוב של כל מדידה TPSF (1 ים), מספר חזרות לכל תפקיד מקור (10), ואת המיקום ואת מספר פרוסות הדמיה הרצוי מתוך הערימה את התמונה CT משלב 3.6. המספרים בסוגריים הם ערכים אופייניים עבור כל פרמטר הדמיה מניב ~ 5 דקות של רכישת נתונים לכל פרוסת הדמיה.
8. מניחים מסננים לחרוץ טריפל (Chroma טכנולוגיה קורפ, שואג פולס, VT) מול PMTs את גילוי הקרינה, להגביל את כל אור לייזר מלהגיע גלאי הקרינה, ו OD 2 מסנני צפיפות ניטרלי מול PMTs זיהוי העברה, כדי למנוע הרוויה של גלאים אלו.
9. הפעל את התוכנה רכישת נתונים, איסוף הקרינה ואת TPSFs העברה בכל תפקיד מוגדר גלאי המקור עבור כל אורך גל עירור (635 ננומטר ו 755 ננומטר לעורר את פלואוריד Alexa 647 ו IRDye 800CW-EGF קליעים נותבים, בהתאמה). עבור קבוצה כל TPSFs אסף, לנטר ולהקליט את עוצמת הלייזרעם ערוץ PMT התייחסות.

4. תמונה לשיקום

1. לקבוע את פני השטח החיצוני של העכבר, את מיקום המיטה מוטות הדמיה תמיכה של התמונות CT ו ליצור מסכות המכסה את גבולות העכבר ואת מוטות הדמיה בנפרד.
2. השתמש בעכבר על מנת לייצר מסיכת רשת סופית, אלמנט של בעלי חיים באמצעות התוכנה NIRFAST ^19.
3. לתהליך הלוקליזציה של המקור גלאי עמדות ממערכת טומוגרפיה הקרינה על פני השטח של רשת המבוססת על microCT והרשמה מרחבית הקרינה הקואורדינטות ^20.
4. הסר אופטיים נקודות נתונים הקשורים עמדות מקור או גלאי כי אינטראקציה עם המיקום של המיטה הדמיה מוטות תמיכה.
5. לנרמל את הנתונים שנאספו על כל עמדה גלאי המקור בהתייחס לייזר, הנכונים עבור להיסחף הזמני בהפניה לייזר, המתאים רגישויות מסנן, אשר נקבעו על ידי בדיקה ניסיונית בעת הרכישה ^15.
6. קח את יחס נולד הנתונים (הקרינה חלקי העברה) לתפקיד מקור גלאי כל ולהתרבות עם סימולציה של מודל קדימה העברה המבוססת על רשת סופית, אלמנט חיה על התכונות האופטיות אחידים. הדבר נעשה כדי לצמצם טעויות הקשורות צימוד מקור או גלאי, רקמות ^21, לכייל את הנתונים למודל ^22, ולהתאים את הנתונים של היבטים אחרים של אי התאמה בין מודל הנתונים ^23,24.
7. לבנות וקטור נתונים מורכב ההבדל בקנה מידה של הנתונים שנאספו יחס שנולדו באורכי גל שני. גורם קנה מידה נבחר על מנת למקסם את הניגוד EGFR מחייב. בצע תחום בזמן שחזור התמונה עם הנתונים ההבדל מכויל באמצעות TPSF עבור כל ערוץ איתור כקלט, וליצור מפות הקרינה של ניגוד משופרת מעקב ממוקד ^15.

5. נציג תוצאות

"> דוגמה שחזור הקרינה ועליהן תמונת CT שיתוף רשום אנטומי מהראש של עכבר עם הגידול U251 glioma orthotopic מוצג באיור 1 ב. מרכז המסה של glioma נקבע על ידי שחזור ניאון (איור 1 ב ) היה במרחק 1 מ"מ של מרכז המסה של הגידול נקבע לעומת זאת, לשפר דימות תהודה מגנטית (איור 1 א). התמונות CT ו-MRI היו רשומים במשותף על שינוי מידע הדדית.

באיור 1. ניגודיות משופרת (גדוליניום) תמונה תהודה מגנטית של הראש העכבר (א). העכבר היה מחוסן orthotopically עם קו U251 glioma האדם התא. המיקום של הגידול, אשר סופגת חומר ניגוד יותר במוח רגיל, ניתן לראות בחצי הכדור המוח השמאלי (מימין בתמונה) והצביע על ידי החץ הלבן. Correspondinגרם ממוחשבת התמונה טומוגרפיה (מאותו מיקום על הראש העכבר) מתואר (ב) עם גורם הגדילה באפידרמיס ממוקד הקרינה מינוס מעולף לא ממוקד שיקום פלואורסצנטי. יחידות הקרינה הן מ"מ הפוך ומתייחסים מקדם את ספיגת הקרינה ממוקד כרוך כפול היעילות הקוונטית שלה על ידי ריכוזו.

Discussion

הקרינה טומוגרפיה (FT) הוא רגיש, קרינה מייננת ללא הדמיה מולקולרית מבוסס על שיטת תחבורה האור הנראה, קרוב אינפרא אדום באמצעות רקמות ביולוגיות. עיקר העניין ב FT התמקדה הפוטנציאל לזרז גילוי סמים ופיתוח חיים קטן מודלים ניסיוניים ¹ ו 1 אזור מפתח של המחקר היה מחקר הביטוי סרטן סמן ותגובה טיפולים מולקולריים ^26. כיום, קיימות שתי גישות מתחרות על עיצוב מערכת FT. העיצוב הנפוץ ביותר מבוסס על מקורר תשלום מצמידים (CCD), מצלמות המכשיר לגילוי הקרינה ^4-9. עיצוב זה מספק צפיפות גבוהה של מדידות, למקסם את הדגימה רקמות מאז כל פיקסל במצלמת CCD יכול לזהות אור נסעה בנתיב ייחודי באמצעות רקמה. עם זאת, מצלמות CCD יש טווח דינמי מוגבל לקריאה מתוך רעש מגביל רגישות האולטימטיבי שלהם. עיצוב 2 נמנע limita פוטנציאל tions של זיהוי מצלמת CCD רגישה מאוד על ידי שימוש יחיד פוטון הטכנולוגיה ספירה המבוססת על שימוש של גלאי כגון צינורות מכפיל או פוטודיודות מפולת ^10-13. החיסרון של אלו שיטות זיהוי רגיש יותר הוא גלאי זה יכול רק לאסוף את האור בנקודה אחת, ולכן, כדי להשיג דגימה רקמה צפופה, בין אם גלאי רבות צריך לשמש (וזה מאוד יקר), או תחזיות רבות יש צילמו עם גלאי זהה (אשר יכול להיות זמן רב). בעוד רמה אופטימלית של הדגימה רקמות עבור FT חיה קטנה לא היו מסכימים עליו, והוא עשוי להשתנות על בסיס כל מקרה לגופו, מוסכם כי יחיד פוטון ספירת מכשור מתאים יותר לבחון את גבולות הרגישות של FT במונחים יכולתה לזהות ריכוזים נמוכים של סמנים מולקולריים. במחקר זה, אנו מספקים מתודולוגיה לביצוע FT באמצעות פוטון יחיד זיהוי מכשור ספירת בתרגום גידולים בעכברים.

אף אוזן גרון "> ישנם ארבעה שלבים קריטיים הכרוכים לייצר מערכי נתונים חזקים עם FT יחיד פוטון זמן בקורלציה לספור. הראשון הוא יישום של הליך כיול מתאים וברור. ב מתודולוגיה הציג, הרגישות המתאימה של כל ערוץ זיהוי מטופלות על ידי איסוף המדידה הבסיסית של אור עירור מועברים באמצעות diffusor קו שנועד לכוון שברים שווים של אור גלאי כל ^15. יתר על כן, לאור זוהה במהלך הניסוי הוא מכויל באופן רציף על הפניה לייזר, מבחינת העוצמה והן אומר . פעמי, אשר יכול להשתנות לאורך זמן, על ידי פעולה של התייחסות לייזר ערוץ ^11,15 שלב קריטי השני הוא אוסף מדויק שיתוף אחת של דימות אנטומי של שחזורים הקרינה מודרכים נתונים FT לבדה אינה מספקת מידע אנטומי. לכן, כדי ליצור מודל התחבורה האור יכול לשמש כדי לשחזר את loקטיון של מקורות ניאון בתוך דגימה מן הקרינה זוהה על פני השטח של הדגימה, האנטומיה של הדגימה ביחס למערכת FT חייב להיות ידוע במדויק. במערכת שלנו, מידע אנטומי נרכש על ידי מערכת מיקרו עם טומוגרפיה ממוחשבת קואורדינטות מרחביות שנרשמו מרחבית עם אלה של המערכת FT ^15,20. שלב קריטי 3 כרוכה להבטיח חשיפה אופטימלית (כלומר, זיהוי סה"כ זמן פוטון של הקרנת כל לייזר) מועסק במיקום מקור גלאי בכל. זה חשוב משתי סיבות: ראשית, להבטיח כי יש מספיק אות לרעש במיקום זה איתור 2, כדי למנוע הרוויה גלאי, אשר עלולים להזיק יחידות איתור. על מנת להשיג חשיפה אופטימלית במיקום כל גלאי, בקרת חשיפה אוטומטית מועסק, אשר למעשה triangulates חשיפה אופטימלית מ 2, נמוך האות חשיפות ^14. 4 קריטיהצעד של המתודולוגיה היא התייחסות לנתונים שנאספו הקרינה לכמות אור עירור המשודר. התייחסות זו נקראת לעיתים קרובות היחס נולד, והוא מספק יתרונות רבים עבור FT, עם 1 העיקרי הוא הקלה של מודל טעויות אי התאמה ב ^23,24. המערכת הציגה נועד לזהות אור עירור הן הקרינה ומועברים בו זמנית על ידי תקשור אור כל ערוץ זיהוי ל -2 צינורות מכפיל נפרדים. בדרך זו, אנו למנוע תופעות של תנועה על הדיוק של היחס נולד.

עם מערך נתונים חזקים לעומת זאת, שחזור דמותו של תחום בזמן הנתונים כרוכה לפתור את הבעיה ההפוכה של רשת אלמנטים סופיים שיש את הביטוי:

D = JX

כאשר D הוא וקטור עם n אלמנטים צילומי מ 'עבור n המקור גלאי תחזיות ו מ TPSF הזמן שערים; J הוא n x מ' אחראני הרגישות מטריקס (או יעקוביאן), עבור צמתים וסעד ב רשת, ו-X הוא וקטור של תכונות אופטיות הקרינה של כל צומת, אני נתקל בגודל D הוא את הנתונים שנאספו במהלך הניסוי מכויל ו-J הוא מדומה באמצעות פתרון אלמנטים סופיים. כדי קירוב תחום דיפוזיה הזמן התחבורה הקרינה ^25. זמן הוא מימד של J convolved גם עם גלאי פונקציות ספציפיות מכשיר התגובה. X הוא ייצוג של המפה הקרינה של עניין נפתרת לשימוש לבנברג-Marqardt שאינו שלילי לפחות הגישה ריבועים עם טיחונוב הסדרה ^15.

השיטה המוצגת כאן, המתאר את הליך מסוגל לאיתור גידולים שכותרתו fluorescently בעכברים באמצעות מאוד רגישים פוטון ספירת זיהוי הקרינה, יש פוטנציאל לדחוף את גבולות FT. במחקר קודם, את הפוטנציאל של שימוש זההגישה גדול מן עכברים דגמים בעלי חיים, כגון חולדות, כמו גם רגישות משופרת על המערכת עיצובים קיימים עכבר בגודל דגימות, הודגם ^17. היישום המיידי של גישה זו היה לניטור הביטוי סמן in vivo במודלים של גידול בעלי חיים קטנים כדי להעריך את יעילות התרופה גבוהה התפוקה האמצעים. היכולת של מערכת לעורר ולגלות הקרינה באורכי גל מרובים מאפשרת זיהוי בו זמני של מספר רב של סמנים ניאון. סמנים ניאון נוספים לספק אמצעי לחקור היבטים שונים של פתולוגיה, בו זמנית, או יכול לשמש, כמו במחקר זה, להעסיק גישות הדמיה כמותיים יותר כמו הכתב כפול שיטות למדידת הפוטנציאל מחייב vivo, סמן של צפיפות קולטני ^26,27.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester	Life Technologies	A20106	Reacted with water to minimize non-specific binding