Summary
In dit artikel wordt de bouw van een multiplex microneedle-gebaseerde sensor. Het apparaat wordt ontwikkeld in situ bemonstering en elektrochemische analyse van meerdere analyten in een snelle en selectief. We zien de klinische geneeskunde en biomedische onderzoek wordt gebruik gemaakt van deze microneedle op basis van sensoren.
Abstract
De ontwikkeling van een minimaal invasieve gemultiplexte monitoring systeem voor snelle analyse van biologisch relevante moleculen zou kunnen bieden personen die lijden aan chronische aandoeningen gemakkelijke beoordeling van hun directe fysiologische toestand. Bovendien kan het dienen als een research tool voor de analyse van complexe, multifactoriële aandoeningen. Om een dergelijke sensor multianalyte te realiseren, moet het minimaal invasieve bemonstering interstitiële vloeistof moet plaatsvinden zonder pijn of schade aan de gebruiker, en analyse moet snel en selectief.
In eerste instantie ontwikkeld voor pijnvrij drug delivery, micronaalden zijn gebruikt om vaccins en farmacologische middelen (bijvoorbeeld insuline) te leveren via de huid. 1-2 Aangezien deze apparaten de interstitiële ruimte toegang te krijgen, kan micronaaldjes die geïntegreerd zijn met micro-elektroden worden gebruikt als transdermale elektrochemische sensor. Selectieve detectie van glucose, glutamaat, lactaat, hydrogen peroxide en ascorbinezuur is aangetoond met geïntegreerde microneedle-stroomdraden met koolstofvezels, gemodificeerd koolstof pasta, en platina-beklede polymère micronaaldjes die als transduceren elementen. 3-7,8
Dit microneedle sensor technologie heeft het mogelijk gemaakt een nieuwe en geavanceerde analytische aanpak voor in-situ en gelijktijdige detectie van meerdere analyten. Multiplexing biedt de mogelijkheid controle complex micromilieus, die anders moeilijk te typeren in een snelle en minimaal invasieve wijze. Bijvoorbeeld, deze technologie kan worden gebruikt voor de gelijktijdige controle van de extracellulaire spiegels van, glucose, lactaat en pH, 9, die van belang zijn metabole indicatoren van ziektebeelden 7,10-14 (bijv. kanker proliferatie) en lichaamsbeweging geïnduceerde acidose. 15
Protocol
1. Microneedle Fabrication
- Met behulp van drie-dimensioneel modelleren software Solidworks (Dassault Systèmes SA, Velizy, Frankrijk), het ontwerpen van een piramide-vormige holle microneedle array (figuur 1). 3-5
- Ontwerp een ondersteunende structuur voor de microneedle array met Magics RP 13 software (Materialise NV, Leuven, België). De draagstructuur kan de hars van het apparaat afvoer tijdens fabricage en een basis waarop de micronaaldjes worden gebouwd. Een voorbeeld draagconstructie in figuur 1.
- De gekoppelde steun en microneedle reeks bestanden worden geüpload naar de Perfactory RP software (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Duitsland), die het productieproces controleert. Binnen deze software pakket, kiest u het aantal microneedle arrays voor verdere verwerking en de plaatsing van de apparaten op de fabricage plaat.
- Run kalibratie in ultraviolet-modus op 180 mW voor de Perfactory snelle prototyping productiesysteem en controleer of de afwijking in energie ligt binnen ± 2 mW.
- Na fabricage is voltooid, verwijdert u de microneedle arrays uit de grondplaat en ontwikkelen in isopropanol gedurende 15 minuten. Droog de reeksen met perslucht en genezen micronaaldjes bij kamertemperatuur gedurende 50 seconden in de Otoflash Postcuring System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Duitsland) volledige polymerisatie waarborgen.
- Valideer microneedle fabricage via microscopie en controleer dat elke microneedle boring is hol en vrij. Volledig vervaardigd micronaaldjes worden getoond in Figuur 2.
2. Fabricage van Carbon plakken Electrode Arrays
- Gebruik een 60 W Model 6,75 CO 2 raster / vector lasersysteem (Universal Laser Systems, Inc, Scottsdale, AZ) om gaten te knippen en de onderliggende individueel adresseerbare het aansluiten van koperen draden bloot in een platte flexibele kabel (21.039 tot 0.249 duizend), die verkregen uit een commerciële bron (MoConnector lex Corp, Lisle, IL) (Figuur 3 (A en B)). Plaats de platte flexibele kabels in een mal om goed te worden aangepast aan de laser ablatie plaat. Gebruik rastervelden benadering 500 micrometer diameter holten in de isolerende gedeelte van de soepele kabel te maken. Patronen voor ablatie worden gemaakt in CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) en opgestuurd naar het lasersysteem.
- Reinig de gewijzigde platte flexibele kabels met een airbrush die sprays aceton bij 40 psi. Beëindig het schoonmaken hen door te spoelen met isopropanol en gedeïoniseerd water. Controleer of onder een microscoop dat er geen isolerende film blijft over de koperen strips.
- De volgende stap is het creëren van een holding holte voor het verpakken van koolstof pasta's. Melinex tape (0,002 "dikte gecoat op een zijde met een drukgevoelige acrylaat lijm) wordt geablateerd met hetzelfde patroon als de elektrode strips, gericht op het te verdampen elektrode strips, en gecomprimeerd op 3000 psi gedurende 2 minuten om een goede aansluiting te garanderen. dit case de holte diameter 750 pm.
- Een extra Melinex band (0,004 "dikte bekleed aan beide zijden drukgevoelige acrylhechtmiddel) wordt vervolgens verwijderd in hetzelfde patroon als enkelzijdige plakband wordt na de aanpassing het hechten van de microneedle arrays de carbon pasta elektrode arrays .
3. Synthese van functionele carbon Pasta's en Verpakking van de elektrode Gaatjes
- De glucose gevoelige koolstof pasta gebaseerd van een eerdere recept wordt verkregen door 10 mg glucoseoxidase en 2,2 mg poly (ethyleenimine) tot een homogeen mengsel is verkregen. 16 Aan dit mengsel 60 mg van rhodium op koolstof poeder ( 5% belasting) toegevoegd. 40 mg minerale olie wordt toegevoegd en vervolgens gemengd. De pasta's bewaard bij 4 ° C tot gebruik, de pasta's worden gebruikt tot een week na de bereiding.
- De pH-gevoelige kool pasta wordt verkregen door mengen 30% (w / w) minerale olie en 70% (w / w) grafiet powder. Verpak plakken in de elektrode holte zoals beschreven in paragraaf 3.4. Merk oplossing van 10 mM Fast Blue RR diazoniumzout (4-benzoylamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium chloride hemi (zinkchloride) zout) in 0,5 M fosforzuur. 17 Breng een druppel 20 ul van deze oplossing via gepakte pasta elektrode 30 minuten spontaan chemisorb de Fast Blue PR diazoniumzout. Spoel na met gedemineraliseerd water en bewaar in de buffer of gedemineraliseerd water wanneer niet in gebruik.
- De lactaat gevoelige koolstof pasta gebaseerd van een eerdere recept wordt verkregen door mengen van 2,5 mg rhodium op koolstofpoeder en 2,5 mg van lactaat oxidase, afwisselend 5 minuten sonificatie en 5 minuten vortexen vijf rotaties 18.
- Verpakking van de gewijzigde pasta in de voorbehandelde platte flexibele kabel door toepassing van de respectieve pasta boven de electrode holten. Met behulp van een dun stukje plastic (bijvoorbeeld een rand van een plastic wegen boot) als een troffel en pak thij plakken tot een glad oppervlak wordt verkregen. Herhaal dit met een tweede schone gewicht van de boot tot overtollige pasta wordt verwijderd. Was met gedemineraliseerd water. Een schematische weergave laser ablatie om gaatjes te maken, het verpakken van carbon pasta's, en microneedle integratie (beschreven in deel 2 en 3) is weergegeven in figuur 3.
4. Detectie en sensor calibratie
- Lactaat detectie vindt plaats door het meten van de chronoamperometric reactie van de sensor -0,15 V en opnemen van de huidige 15 seconden in 0,1 M fosfaatbuffer (pH = 7,5). Figuur 4 (a) een schematische voorstelling van de elektrokatalytische reactie voor de detectie van lactaat bevat .
- Glucose detectie wordt uitgevoerd op dezelfde wijze door het meten van de chronoamperometric reactie van de sensor -0,05 V en opnemen van de huidige 15 seconden in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,0). Figuur 4 (b) een schematische weergave van de reactie voor elektrokatalytische detection glucose.
- pH wordt gecontroleerd door het uitvoeren van cyclische voltammetrische scans van -0,7 V tot 0,8 V 100 mV / s en vastleggen van de positie van de oxidatieve piek potentieel. Een schematische weergave van de redoxreacties voor pH detectie in figuur 5.
- Ijklijnen voor glucose en lactaat sensoren kunnen worden gemaakt door opeenvolgende toevoegingen van de betrokken analyt; chronoamperometric metingen uitvoeren na elke analyt aanvulling als beschreven in paragraaf 5.1 en 5.2. U kunt vaste potentiaal chronoamperometric metingen worden verricht onder roeren waarbij voldoende tijd (~ 10-100 seconden) tussen elke analyt aanvulling voor de huidige stabilisatie.
- pH ijklijnen kunnen worden gemaakt door meten van de positie van de oxidatieve piek mogelijke over een reeks pH bekend 5-8 in 1.0 pH eenheid stappen en opnemen cyclische voltammogrammen zoals beschreven in 5.3.
5. Vertegenwoordiger van Resultaten
Bij het verkrijgen van chronoamperometric bochten (bijvoorbeeld voor detectie glucose of lactaat detectie) in rust-oplossingen met aangepaste carbon plakken gevuld micronaalden, zal de huidige onmiddellijk te verlagen op verzoek van de desbetreffende detectie-potentieel. Het zal uiteindelijk vergaan tot een steady-state waarde. Een representatief resultaat wordt getoond in Figuur 6; dit resultaat werd verkregen uit 2 mM toevoegingen van lactaat en het opnemen met de lactaat microneedle. De oplossing kort worden geroerd na elke lactaat toevoeging. De huidige na 15 seconden stijgt bij toenemende concentratie van lactaat, de huidige reactie kan dan worden gebruikt om de concentratie van lactaat bepalen in een onbekende oplossing. Als alternatief kan continue bewaking worden in een geroerde oplossing (of in een stromende oplossing), zoals blijkt een oplossing met een toenemend glucose concentratie (Figuur 5). Ook de bijdrage van de bij toenemende thij glucoseconcentratie kan worden gebruikt om de glucose reactie op een onbekende oplossing standaardiseren. Er moet voldoende tijd worden toegestaan na elke piek, zodat de oplossing te stabiliseren. Cyclische voltammogrammen de pH-gevoelige microneedle in 0,1 M fosfaatbuffer wordt over vier pH oplossingen 5-8 in een pH-eenheid stappen in figuur 6. De oxidatieve piek mogelijke verschuivingen met toenemende pH, dit verschijnsel wordt gebruikt als indicator van de pH.
Figuur 1. Afbeeldingen van het STL-bestand van het microneedle array gemaakt in Solidworks (A) en de druk scherm waarvan de draagstructuur (B) toont.
Figuur 2. Rasterelektronenmicrografieën de microneedle matrix (A) en een microneedle in deze matrix (B).
Figuur 3. Schematische voorstelling van platte flexibele kabel montage. De betrokken stappen omvat het wijzigen van de platte flexibele kabel (A) wegnemen van de patroon cirkels (B), waarbij de eerste geablateerd Melinex laag die is gevuld met koolstof pasta (C), en toevoegen van de tweede laag en verdampen Melinex paren de microneedle array (D). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Kalibratie van lactaat-gevoelige pasta met 15 seconden chronoamperometric scans -0,15 V in 0,1 M fosfaatbuffer (pH = 7,5). Elke verhoging in de huidige overeen met een 2 mM toevoeging van lactaat.
Figuur 5.
Figuur 6. Cyclische voltammogram (CV) van pH-gevoelige koolstof plak in 0,1 M fosfaatbuffer pH op 5-8 in een pH-eenheid stappen (blauwgroen = pH 8,0, groen = pH 7,0, paars = pH 6,0, rood = pH 5,0). Een vijfde CV werd gebruikt voor de analyse ten opzichte van Ag / AgCl referentie-en Pt draad tegen de elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meerdere aspecten van het ontwerp van deze microneedle-gebaseerde sensor werden beschouwd als voorafgaand aan het apparaat fabricage. Om deze sensor gebruikt voor real-time detectie moet de respons van de sensor laag, in dit protocol elk getest sensor vertoonde een reactietijd onder vijftien seconden. Pasta's die in dit protocol werden ook gekozen omwille van hun selectiviteit binnen de in vivo-omgevingen, die elektroactieve biomoleculen die kunnen interfereren met elektrode reactie bevatten. Naast samenstelling plakken werden de operationele potentialen gekozen om de invloed van storende electro soorten minimaliseren. Succesvolle vervaardiging van de micronaald matrix omvat het selecteren van een geschikte microneedle ontwerp en microneedle materiaal. Deze twee aspecten zullen bepalen of de microneedle kunnen doorprikken van de huid, de bescherming van de elektroden tegen materiële schade, en de weg elektrode-contact met het weefsel. Opgemerkt een externe Ag / AgCl en Pt betrekkingervaring en tegen de elektroden werden gebruikt tijdens de metingen, in vivo gebruik van dit apparaat met menselijke of dierlijke onderwerpen zou vereisen dat deze elektroden worden opgenomen in het apparaat.
Elk onderdeel van de microneedle-gebaseerde sensor heeft functies die moeten worden gevalideerd om een juiste werking te garanderen. Kwaliteitscontrole tijdens wijziging van de platte flexibele kabel (figuur 3 B) zeggen dat bij de isolerende laag volledig is verwijderd van het oppervlak van de vertinde koperdraden na laser ablatie (figuur 3). Als de isolerende laag uit het oppervlak van de koperdraad na laser ablatie kan onregelmatige reacties door onvolledige elektrisch contact. De laser-ablatie Melinex tape moet worden onderzocht met een microscoop dat de diameter van elke opening in overeenstemming is aangezien hierin het werkgebied van de elektrode. Bij de toepassing van carbon plakken om de laser-ablatie Melinex tape holten,de pasta moet voldoen aan de exacte gatdiameter zonder overmaat om signaalveranderingen gevolg van verschillen in oppervlakte vermeden. Tijdens chronoamperometric metingen met aangepaste carbon pasta's, moet het signaal te stabiliseren op een grenswaarde voor de stroom wordt opgenomen. Deze resultaten kunnen enigszins variëren door mengen effecten. Mechanische testen van de microneedle arrays werd uitgevoerd voorafgaand aan de sensor opname, in een eerdere studie, onze groep toonde deze arrays in staat waren prikken varkens huid, die werd gebruikt als een analoog voor de menselijke huid 3 micronaaldjes arrays moet vervorming of breuk niet ondergaan tijdens. huidpenetratie, omdat deze processen kan leiden tot elektrode schade.
Dit protocol is gedetailleerd de bouw van een nieuwe inrichting voor transdermale elektrochemische controle. We zien de toekomstige inspanningen met betrekking tot microneedle sensoren met een nog groter aantal individueel adresseerbare micronaaldjes en een grotere verscheidenheid aan transducers. Dit apparaat is ontworpen voor de analyse van het interstitiële vocht bij de mens, het gebruik met dieren is ook mogelijk met de juiste soort-specifieke aanpassingen aan microneedle design. Toekomstige deze techniek omvatten, maar zijn niet beperkt op afstand patiëntenbewaking en gekoppeld aan een drug delivery inrichting voor automatische detectie-drug delivery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Sandia is multiprogram laboratorium geëxploiteerd door Sandia Corporation, een Lockheed Martin Company, voor de Verenigde Staten voor Department of National Nuclear Security Administration Energy's onder contract DE-AC04-94AL85000. De auteurs erkennen de financiering van Laboratorium Sandia National Laboratories 'Geregisseerd Research & Development (LDRD) programma.
References
- Henry, S., McAllister, D. V., Allen, M. G., Prausnitz, M. R. Microfabricated microneedles: a novel approach to transdermal drug delivery. J. Pharm. Sci. 87, 922-925 (1998).
- Prausnitz, M. R. Microneedles for transdermal drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 581-587 (2004).
- Miller, P. R., Gittard, S. D., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Xiao, X., Wheeler, D. R., Monteiro-Riviere, N. A., Brozik, S. M., Polsky, R., Narayan, R. J. Integrated carbon fiber electrodes within hollow polymer microneedles for transdermal electrochemical sensing. Biomicrofluidics. 5, 013415-013415 (2011).
- Windmiller, J. R., Zhou, N., Chuang, M. C., Valdés-Ramírez, G., Santhosh, P., Miller, P. R., Narayan, R., Wang, J. Microneedle array-based carbon paste amperometric sensors and biosensors. Analyst. 136, 1846-1851 (2011).
- Windmiller, J. R., Valdés-Ramírez, G., Zhou, N., Zhou, M., Miller, P. R., Jin, C., Brozik, S. M., Polsky, R., Katz, E., Narayan, R., Wang, J. Bicomponent microneedle array biosensor for minimally-invasive glutamate monitoring. Electroanal. 23, 2302-2309 (2011).
- Ricci, F., Moscone, D., Palleschi, G. Ex vivo continuous glucose monitoringwith microdalysis technique: The example of GlucoDay. IEEE Sensors J. 8, 63-70 (2008).
- Zimmermann, S., Fienbork, D., Flounders, A. W., Liepmann, D. In-device enzyme immobilization: Wafer-level fabrication of an integrated glucose. Sens. Actuat. B. 99, 163-173 (2004).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Biomicrofluidics. 88, 739-742 (2012).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Talanta. 88, 739-742 (2012).
- Rofstad, E. K.
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Warburg, O., Wind, F., Negelein, E.
- The Tumour Microenvironment: Causes and Consequences of Hypoxia and Acidity. Novartis Foundation Symposium 240. Goode, J. A., Chadwick, D. J. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
- Cardone, R. A., Casavola, V., Reshkin, S. J. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nature Rev. Cancer. 5, 786-795 (2005).
- Robergs, R. A., Ghiasvand, F., Parker, D.
- Wang, J., Liu, J., Chen, L., Lu, F. Highly selective membrane-free, mediator-free glucose biosensor. Anal. Chem. 66, 3600-3603 (1994).
- Makos, M. A., Omiatek, D. M., Ewing, A. G., Heien, M. L. Development and characterization of a voltammetric carbon-fiber microelectrode pH sensor. Langmuir. 26, 10386-10391 (2010).
- Wang, J., Chen, Q., Pedrero, M. Highly selective biosensing of lactate at lactate oxidase containing rhodium-dispersed carbon paste electrodes. Anal. Chem. Acta. 304, 41-46 (1995).
