Summary
Este artículo detalla la construcción de un multiplexado basado en el sensor de microagujas. El dispositivo está siendo desarrollado para el muestreo in situ y el análisis electroquímico de múltiples analitos en una manera rápida y selectiva. Tenemos la visión de la medicina clínica y la investigación biomédica utiliza para estos sensores de microagujas basadas en.
Abstract
El desarrollo de un sistema de monitorización mínimamente invasiva multiplexado para el análisis rápido de las moléculas biológicamente relevantes podrían ofrecer a las personas que sufren de condiciones médicas crónicas evaluación fácil de su estado fisiológico inmediato. Además, podría servir como una herramienta de investigación para el análisis de las condiciones médicas complejas, multifactoriales. A fin de que dicho sensor multianalítico a ser realizado, debe ser mínimamente invasiva, el muestreo de líquido intersticial debe ocurrir sin dolor o daño para el usuario, y el análisis debe ser rápido, así como selectiva.
Inicialmente desarrollado para el dolor sin la administración de fármacos, microagujas han sido utilizados para entregar vacunas y agentes farmacológicos (por ejemplo, insulina) a través de la piel. 1-2 Puesto que estos dispositivos acceder al espacio intersticial, microagujas que se integran con microelectrodos se puede utilizar como transdérmica electroquímicas sensores. Detección selectiva de la glucosa, glutamato, lactato, hácido peróxido ydrogen, y ascórbico se ha demostrado utilizando electrodos integrados microaguja-dispositivos con fibras de carbono, modificados pastas de carbono, y revestidos de platino-microagujas polímeros que sirven como elementos de transducción. 3-7,8
Esta tecnología de sensores de microagujas ha permitido un enfoque novedoso y de análisis sofisticado para la detección in situ y simultánea de múltiples analitos. Multiplexación ofrece la posibilidad de monitorear microambientes complejos, que son de otra manera difícil de caracterizar de una manera rápida y mínimamente invasiva. Por ejemplo, esta tecnología podría ser utilizada para el control simultáneo de los niveles extracelulares de, glucosa, lactato y pH 9, que son importantes indicadores metabólicos de estados de enfermedad 7,10-14 (por ejemplo, cáncer de proliferación) y acidosis inducida por el ejercicio. 15
Protocol
1. Fabricación Microneedle
- Uso de modelado tridimensional software de SolidWorks (Dassault Systèmes SA, Vélizy, Francia), el diseño de una matriz de forma piramidal de microagujas huecas (Figura 1) 3-5.
- Diseñar una estructura de apoyo para la matriz de microagujas con Magics RP 13 software (Materialise NV, Lovaina, Bélgica). La estructura de soporte permite que la resina para drenar desde el dispositivo durante la fabricación y proporciona una base sobre la cual las microagujas están construidos. Una estructura de soporte ejemplo se muestra en la Figura 1.
- El apoyo vinculados y archivos de la matriz de microagujas se cargan en el software Perfactory RP (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Alemania), que controla el proceso de fabricación. Dentro de este paquete de software, seleccione el número de matrices de microagujas que se fabrican y determinar la colocación de dispositivos en la placa de fabricación.
- Ejecute la calibración en el modo de ultravioleta a 180 mW para el pr Perfactory rápidasistema de ototyping de fabricación y verificar la desviación de la energía es de ± 2 mW.
- Una vez que la fabricación, retire las matrices de microagujas de la placa base y desarrollar en isopropanol durante 15 minutos. Seque las matrices con aire comprimido y curar las microagujas a temperatura ambiente durante 50 segundos en el Sistema de Otoflash postvulcanizado (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Alemania) para asegurar la polimerización completa.
- Validar la fabricación de microagujas a través de microscopía y verifique que cada agujero de microagujas es hueco y sin obstrucciones. Microagujas totalmente fabricados se muestra en la Figura 2.
2. Fabricación de Matrices electrodo de pasta de carbono
- Utilizar un 60 Modelo W 6,75 CO 2 de trama / vector de sistema láser (Universal Laser Systems, Inc., Phoenix, AZ) para cortar agujeros y exponer los subyacentes individualmente direccionables que conectan los cables de cobre en un cable plano flexible (21.039-0.249), que fue obtenida de una fuente comercial (MoLex conector Corp., Lisle, IL) (Figura 3 (A y B)). Coloque los cables flexibles planas en una plantilla para alinear apropiadamente en la placa de ablación con láser. Utilizar un enfoque de barrido para crear cavidades 500 m de diámetro en la porción aislante del cable flexible. Patrones para la ablación se crean en CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) y se envía al sistema de láser.
- Limpie los cables flexibles planos modificados con un aerógrafo que la acetona aerosoles a 40 psi. Terminar la limpieza ellos por aclarado con agua desionizada y el isopropanol. Compruebe bajo un microscopio que ninguna película aislante permanece sobre las tiras de cobre expuestas.
- El siguiente paso es crear una cavidad sujeción para el envasado de pastas de carbono. Cinta Melinex (0,002 "de espesor recubierta por una sola cara con adhesivo acrílico sensible a la presión) se realiza la ablación con el mismo patrón que las tiras de los electrodos, orientados sobre las tiras de electrodos ablacionadas y comprimidos a 3000 psi durante 2 minutos para asegurar una conexión adecuada. En esta case, el diámetro de la cavidad es de 750 micras.
- Una capa adicional de cinta Melinex (0,004 "de espesor recubierta por dos lados con adhesivo acrílico sensible a la presión) posteriormente se realiza la ablación en el mismo patrón que la cinta adhesiva de una sola cara y se utiliza después de la alineación para unir las matrices de microagujas a las matrices de electrodos de carbono pasta .
3. Síntesis de las pastas de carbono funcionales y embalaje de la caries de electrodos
- La pasta de glucosa carbono sensible se basa fuera de una receta anterior y se obtiene mezclando 10 mg de glucosa oxidasa y 2,2 mg de poli (etilenimina) hasta obtener una mezcla homogénea. 16 A esta mezcla, 60 mg de rodio sobre carbón en polvo ( 5% de carga), se añade. 40 mg de aceite mineral se añade y se mezcla posteriormente. Las pastas se almacenan a 4 ° C hasta su uso; las pastas se utilizan hasta una semana después de la preparación.
- La pasta de pH sensible carbono se obtiene por mezcla de aceite mineral al 30% (w / w) y 70% (w / w), grafito powder. Paquete de pegar en la cavidad del electrodo, como se describe en la sección 3.4. Hacer solución de 10 mM de sal Fast Blue RR diazonio (4-benzoilamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium cloruro hemi (cloruro de zinc) sal) en 0,5 M de ácido fosfórico. 17, Coloque una caída de 20 l de esta solución sobre el electrodo de pasta de envasado para 30 minutos para chemisorb espontáneamente el Fast Blue sal de diazonio de relaciones públicas. Enjuagar con agua desionizada y tienda en tampón o agua desionizada cuando no esté en uso.
- La pasta de lactato de carbono sensible se basa fuera de una receta anterior y se obtiene mezclando 2,5 mg de rodio sobre carbono en polvo y 2,5 mg de lactato oxidasa, alternando entre 5 minutos de sonicación y 5 minutos de agitación durante cinco rotaciones. 18
- Embalaje de las pastas modificados en el preparado del cable plano flexible se logra mediante la aplicación de las pastas respectivos sobre las cavidades de los electrodos. Usando una fina pieza de plástico (por ejemplo, un borde de un plástico pesan barco) como una paleta y t paqueteél pega hasta una superficie lisa se logra. Repita el proceso con un segundo barco limpio de pesaje hasta que la pasta se elimina el exceso. Lavar con agua desionizada. Un esquema que muestra la ablación con láser para crear cavidades, envasado de pastas de carbono, y la integración microaguja (descrito en la sección 2 y 3) se presenta en la Figura 3.
4. La detección y la calibración del sensor
- Detección de lactato se logra mediante la medición de la respuesta del sensor chronoamperometric a -0,15 V y grabación de la corriente después de 15 segundos en 0,1 M de tampón fosfato (pH = 7,5). Figura 4 (a) contiene un esquema de la reacción electrocatalítica para la detección de lactato .
- Detección de glucosa se realiza de una manera similar mediante la medición de la respuesta del sensor chronoamperometric a -0,05 V y grabación de la corriente después de 15 segundos en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Figura 4 (b) contiene un esquema de la reacción electrocatalítica para detection de glucosa.
- pH se controla mediante la ejecución cíclicos exploraciones voltamétricos desde -0,7 V a 0,8 V a 100 mV / s, y registrar la posición del pico de potencial oxidativo. Un esquema de las reacciones redox para la detección del pH se muestra en la Figura 5.
- Las curvas de calibración para la glucosa y lactato sensores pueden ser creados por adiciones sucesivas de la analito respectivo; mediciones chronoamperometric se realiza después de cada adición analito como se describe en las secciones 5.1 y 5.2. Por otra parte, las mediciones fijas chronoamperometric potenciales se pueden hacer con agitación al tiempo que permite un tiempo suficiente (aproximadamente 10-100 segundos) entre cada adición analito para la estabilización actual.
- Las curvas de calibración de pH puede ser creada mediante la medición de la posición del pico de potencial oxidativo durante una serie de valores de pH conocidos de 5 a 8 en incrementos de 1,0 unidad de pH y registrar voltamogramas cíclicos como se describe en la sección 5.3.
5. Representante Reresultados
Al obtener curvas chronoamperometric (por ejemplo, para la detección de glucosa o la detección de lactato) en soluciones quiescentes con carbono modificada pega-llenos microagujas, la corriente disminuirán inmediatamente tras la aplicación del potencial de detección respectivo. Con el tiempo se reduzca a un valor de estado estacionario. Un resultado representativo se muestra en la Figura 6; este resultado se obtuvo a partir de 2 adiciones mM de lactato y de grabación a la microaguja lactato. La solución debe ser brevemente agitó después de cada adición de lactato. La corriente después de 15 segundos se eleva al aumentar la concentración de lactato; la respuesta de corriente puede ser utilizado para determinar la concentración de lactato en una solución desconocida. Alternativamente, la vigilancia continua puede ser utilizada en una solución agitada (o en una solución que fluye) como se demuestra por una solución con una concentración de glucosa en aumento (Figura 5). De nuevo, el aumento en la corriente al aumentar tque la concentración de glucosa puede ser utilizada para normalizar la respuesta de la glucosa a una solución desconocida. Tiempo suficiente se debe permitir que después de cada espiga con el fin de permitir que la solución se estabilice. Voltamogramas cíclicos en la microaguja sensible al pH en tampón fosfato 0,1 M se muestran más de cuatro soluciones diferentes de pH de 5 a 8 en incrementos de 1 unidad de pH en la Figura 6. Los cambios oxidativos pico potenciales con el aumento del pH; este fenómeno se utiliza como un indicador del valor del pH.
Figura 1. Imágenes del archivo STL de la matriz de microagujas creado en Solidworks (A) y de la pantalla de impresión, que muestra la estructura de soporte (B).
Figura 2. Micrografías electrónicas de barrido de la matriz de microagujas (A) y una microaguja único dentro de esta matriz (B).
Figura 3. Esquema de montaje de cable plano flexible. Los pasos implicados incluyen la modificación del cable plano flexible (A), la ablación de los círculos estampados (B), añadiendo el inicialmente ablated capa Melinex, que está lleno con carbón pasta (C), así como la adición de la segunda capa ablacionada Melinex y acoplar el matriz de microagujas (D). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. Calibración de lactato-sensible pasta con 15 exploraciones segundo chronoamperometric a -0,15 V en 0,1 M de tampón fosfato (pH = 7,5). Cada aumento de la corriente corresponde a una adición de 2 mM de lactato.
Figura 5.
Figura 6. Voltamograma cíclico (CV) de carbono, sensible al pH pega en tampón fosfato 0,1 M pH durante 5-8 en incrementos de 1 unidad de pH (pH 8,0 = verde azulado, verde = pH 7,0, púrpura = pH 6,0, rojo = pH 5,0). Un CV quinto se usó para el análisis en comparación con referencia Ag / AgCl y electrodos de Pt de alambre de venta libre.
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Discussion
Múltiples aspectos del diseño de este sensor de microagujas basado fueron considerados antes de la fabricación del dispositivo. Para poder utilizar este sensor de detección en tiempo real, el tiempo de respuesta del sensor debe ser baja, en este protocolo, cada sensor de prueba mostraron un tiempo de respuesta por debajo de quince segundos. Las pastas se utilizan en este protocolo fueron elegidos también por su selectividad en vivo en ambientes que contienen biomoléculas electroactivos que pueden interferir con la respuesta del electrodo. Además de pegar composición, los potenciales de funcionamiento fueron elegidos para minimizar la influencia de especies interferentes electroactivos. Fabricación con éxito de la matriz de microagujas implica la selección de un diseño adecuado y el material microaguja microaguja. Estos dos aspectos se determinará si la microaguja puede perforar la piel, la protección de los electrodos de cualquier daño físico, y evitar el contacto electrodo-tejido. Cabe señalar que una externa de Ag / AgCl y Pt refierenEnce electrodos y el contador se utiliza durante las mediciones; utilización in vivo de este dispositivo con sujetos humanos o animales sería necesario que estos electrodos se incorporan dentro del dispositivo.
Cada componente del sensor de microagujas con sede en cuenta las características que deben ser validados para garantizar un funcionamiento correcto. El control de calidad durante la modificación del cable flexible plano (Figura 3 B) consiste en asegurar que la capa aislante se elimina completamente de la superficie de los hilos de cobre estañado después de la ablación por láser (Figura 3). Si no se retira la capa aislante de la superficie del alambre de cobre después de la ablación por láser puede causar respuestas irregulares debido a contacto eléctrico incompleta. La cinta de ablación por laser Melinex necesita ser examinada con un microscopio para asegurar que el diámetro de cada abertura es consistente ya que define la zona de trabajo del electrodo. Al aplicar carbono pega a las cavidades de cinta de ablación por laser Melinex,la pasta debe ajustarse al diámetro agujero exacto sin exceso con el fin de evitar variaciones de la señal debido a diferencias en la superficie. Durante las mediciones chronoamperometric con pastas de carbono modificados, la señal debe estabilizar a un valor límite antes de corriente se registra. Estos resultados pueden variar ligeramente debido a los efectos de mezclado. Las pruebas mecánicas de las matrices de microagujas se llevó a cabo antes de la incorporación del sensor, en un estudio previo, nuestro grupo mostró que estos arreglos eran capaces de perforar la piel porcina, que fue utilizada como un análogo para la piel humana 3 matrices de microagujas que no deben ser sometidos a la deformación o fractura durante. penetración en la piel, ya que estos procesos pueden llevar al daño de los electrodos.
Este protocolo ha detallado la construcción de un nuevo dispositivo transdérmico para la monitorización electroquímica. Tenemos la visión de los futuros esfuerzos que involucran sensores de microagujas con un número aún mayor de microagujas dirigidos individualmente y una mayor variedad de transducers. Este dispositivo fue diseñado para el análisis del líquido intersticial en los seres humanos, el uso de animales también es posible con las correspondientes especies específicas de las modificaciones en el diseño de microagujas. Direcciones futuras con esta tecnología incluyen pero no están limitados a la monitorización del paciente a distancia, así como el acoplamiento con un dispositivo de suministro de drogas para la detección automatizada-administración de fármacos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Sandia es un laboratorio multiprograma operado por Sandia Corporation, una compañía de Lockheed Martin, para el Reino Dicho Departamento de Nacional de Energía Nuclear Security Administration bajo el contrato DE-AC04-94AL85000. Los autores agradecen la financiación del Laboratorio Nacional de Sandia Laboratories Dirección de Investigación y Desarrollo (LDRD) del programa.
References
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