Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

Summary

Dieser Artikel beschreibt den Bau eines Multiplex-Mikronadel-basierten Sensor. Das Gerät wird für die in situ Probenahme und elektrochemischen Analyse von mehreren Analyten in einer schnellen und selektiven Weise entwickelt. Wir haben die Vision der klinischen Medizin und der biomedizinischen Forschung verwendet für diese Mikronadel-basierte Sensoren.

Abstract

Die Entwicklung einer minimal-invasiven Multiplex-Monitoring-System für die schnelle Analyse von biologisch-relevante Moleküle bieten konnte Individuen mit chronischen Erkrankungen facile Bewertung ihrer unmittelbaren physiologischen Zustand. Darüber hinaus könnte es als Recherche-Tool für die Analyse von komplexen, multifaktoriellen Erkrankungen dienen. Um für einen solchen Multianalyt Sensor realisiert werden, muss es minimal-invasive, Probenahme von interstitiellen Flüssigkeit muss ohne Schmerzen oder Schäden für den Benutzer auftreten, und die Analyse muss schnell als auch selektiv.

Zunächst für die schmerzfreie Drug Delivery entwickelt, Mikronadeln wurden zur Herstellung von Vakzinen und pharmakologische Mittel (zB Insulin) durch die Haut zu liefern. ^1-2 Da diese Geräte in den interstitiellen Raum zuzugreifen, können Mikronadeln, die mit Mikroelektroden integriert sind als transdermales verwendet werden elektrochemischen Sensoren. Die selektive Detektion von Glucose, Glutamat, Lactat, hydrogen Peroxid und Ascorbinsäure wurde anhand von integrierten Mikronadel-Elektrodeneinrichtungen mit Kohlefasern, modifizierte Kohlenstoffprodukt Pasten, und Platin-beschichteten Polymer Mikronadeln, die als Wandlerelemente. ^3-7,8

Diese Mikronadel Sensorik hat einen neuartigen und anspruchsvollen analytischen Ansatz zur in-situ und simultane Detektion von mehreren Analyten aktiviert. Multiplexing bietet die Möglichkeit der Überwachung komplexer Mikroumgebungen, die sonst nur schwer in einer schnellen und minimal-invasive Weise zu charakterisieren sind. Zum Beispiel kann diese Technik zur gleichzeitigen Überwachung der extrazelluläre Konzentration von könnte verwendet werden, Glukose, Laktat und pH-Wert ⁹ sind wichtige Indikatoren für metabolische Erkrankungen ^7,10-14 (zB Krebs Proliferation) und belastungsinduzierten Azidose. ¹⁵

Protocol

1. Microneedle Fabrication

1. Mit dreidimensionalen Modellierung Software Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Frankreich), die Gestaltung eines pyramidal-förmige hohle Mikronadel Array (Abbildung 1). ^5.3
2. Entwerfen Sie eine Struktur zur Unterstützung der Mikronadelarrays mit Magics RP 13 Software (Materialise NV, Leuven, Belgien). Die Trägerstruktur kann das Harz aus der Vorrichtung während der Herstellung Drain und stellt eine Basis, auf der die Mikronadeln gebaut. Ein Beispiel Trägerstruktur in 1 gezeigt.
3. Die verknüpfte Unterstützung und Mikronadelarrays Dateien werden in den Perfactory RP-Software (envisionTEC GmbH, Gladbeck, Deutschland), die den Herstellungsprozess steuert hochgeladen. In diesem Software-Paket auswählen, die Anzahl der Mikronadel Arrays hergestellt werden, und die Platzierung von Vorrichtungen auf die Herstellung Platte.
4. Führen Kalibrierung im Ultraviolett-Modus bei 180 mW für den schnellen Perfactory prototyping Fertigungssystem und überprüfen Sie die Abweichung in der Energie liegt innerhalb von ± 2 mW.
5. Nach Fertigung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Mikronadelarrays von der Grundplatte und in Isopropanol entwickeln für 15 Minuten. Trocknen Sie die Arrays mit Druckluft und heilen die Mikronadeln bei Raumtemperatur für 50 Sekunden in der Otoflash Nachhärtung System (envisionTEC GmbH, Gladbeck, Deutschland), um eine vollständige Polymerisation sicherzustellen.
6. Bestätigen Mikronadel Fertigung über Mikroskopie und überprüfen, ob jeder Mikronadel Bohrung hohl und nicht behindert wird. Voll hergestellt Mikronadeln sind in Abbildung 2 dargestellt.

2. Herstellung von Kohlenstoff-Paste Elektroden-Arrays

1. Verwenden Sie eine 60-W-Modell 6,75 CO _2-Raster-/ Vektor-Laser-System (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ), um Löcher schneiden und legen das darunterliegende einzeln adressierbar Anschluss Kupferdrähte in einem Flachbandkabel (21039-0249), das war erhalten von einer kommerziellen Quelle (Molex-Connector Corp, Lisle, IL) (Abbildung 3 (A und B)). Legen Sie die flache flexible Kabel in einer Spannvorrichtung richtig auszurichten sie auf der Laser-Ablation Platte. Mit einem Ansatz Rasterung bis 500 Mikrometer Durchmesser Hohlräume in dem isolierenden Abschnitt des flexiblen Kabels zu schaffen. Patterns für die Ablation werden in CorelDraw erstellt (Corel, Ottawa, Ontario) und an das Lasersystem.
2. Reinigen Sie die modifizierte flache flexible Kabel mit einem Airbrush, dass Sprays Aceton bei 40 psi. Beenden der Reinigung sie durch Spülen mit entionisiertem Wasser und Isopropanol. Überprüfen unter einem Mikroskop, dass kein Isolierfilm über den freiliegenden Kupferstreifen bleibt.
3. Der nächste Schritt besteht darin, ein Haltehohlraum für die Verpackung von Kohlenstoff-Pasten zu schaffen. Melinex Bandes (0,002 "Dicke auf einer einzigen Seite mit einem druckempfindlichen Acrylklebstoff beschichtet) mit dem gleichen Muster wie die Elektrodenstreifen, ausgerichtet in den abgetragenen Elektrodenstreifen und komprimiert bei 3000 psi für 2 Minuten, um eine sichere Verbindung zu gewährleisten abgetragen. In Dieses CAse ist der Hohlraum Durchmesser 750 um.
4. Eine zusätzliche Schicht Melinex Bandes (0,004 "Dicke auf beiden Seiten mit druckempfindlichen Acrylkleber) wird anschließend in dem gleichen Muster wie dem einseitigen Klebeband abgetragen wird und nach der Ausrichtung zum Binden der Mikronadelarrays zu den Kohlenstoff-Paste Elektroden-Arrays .

3. Synthese von funktionellen Carbon-Pasten und Verpackung der Elektroden-Kavitäten

1. Die Glucose-empfindliche Kohlepaste wird einer vorhergehenden Rezept und wird durch Mischen von 10 mg Glucoseoxidase und 2,2 mg Poly (ethylenimin), bis eine homogene Mischung erhalten wird. ¹⁶ Zu dieser Mischung wurden 60 mg Rhodium auf Kohlenstoff-Pulver ( 5% Beladung) zugegeben. 40 mg Mineralöl zugegeben und anschließend gemischt. Die Pasten werden bei 4 ° C bis zur Verwendung der Pasten sind bis zu einer Woche nach der Herstellung verwendet.
2. Die pH-empfindlichen C Paste durch Mischen von 30% (w / w) Mineralöl und 70% (w / w) p Graphit erhaltenowder. Packen Sie fügen in die Elektrode Hohlraum, wie in Abschnitt 3.4 beschrieben. Machen Lösung von 10 mM Fast Blue RR Diazoniumsalz (4-Benzoylamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium Chlorid Hemi (Zinkchlorid) Salz) in 0,5 M Phosphorsäure. ^17. Legen Sie eine 20 ul Tropfen dieser Lösung über das verpackte Paste-Elektrode für 30 Minuten, um spontan die Chemisorption Fast Blue PR Diazoniumsalz. Mit deionisiertem Wasser abspülen und zwischenspeichern oder entionisiertes Wasser bei Nichtgebrauch.
3. Die Laktat-sensitiven Kohlepaste wird von einem vorherigen Rezept und wird durch Mischen von 2,5 mg Rhodium auf Kohlenstoff-Pulver und 2,5 mg Lactat-Oxidase erhalten, im Wechsel zwischen 5 Minuten und 5 Minuten Beschallung von Vortexen für fünf Umdrehungen. ¹⁸
4. Verpackung der modifizierten Pasten in den vorbereiteten flachen flexiblen Kabels wird durch Anlegen der jeweiligen Pasten in den Hohlräumen Elektrode erreicht. Durch eine dünne Stück Plastik (z. B. eine Kante aus einem Kunststoff wiegen Boot) als Packung Kelle und ter fügen, bis eine glatte Oberfläche erzielt wird. Wiederholen Sie mit einem zweiten sauberen Boot mit einem Gewicht von bis überschüssige Paste entfernt wird. Waschen mit destilliertem Wasser. Eine schematische Darstellung, Laserablation, um Hohlräume zu schaffen, Verpacken von Kohlenstoff-Pasten und Mikronadel Integration (beschrieben in Abschnitt 2 und 3) ist in Abbildung 3 dargestellt.

4. Erkennung und Kalibrierung des Sensors

1. Lactate über die Messung der chronoamperometrischen Reaktion des Sensors auf -0,15 V und der Aufzeichnung des aktuellen nach 15 Sekunden in 0,1 erreicht M Phosphatpuffer (pH = 7,5). 4 (a) eine schematische Darstellung der elektrokatalytischen Reaktion zur Detektion von Laktat .
2. Glucose Nachweis wird in ähnlicher Weise durch Messen der chronoamperometrischen Reaktion des Sensors auf -0,05 V und der Aufzeichnung des aktuellen nach 15 Sekunden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) durchgeführt. 4 (b) eine schematische Darstellung der elektrokatalytischen Reaktion detection von Glukose.
3. pH-Wert wird durch Ausführen cyclovoltammetrische Scans von -0,7 V bis 0,8 V bei 100 mV / s und Aufzeichnen der Position des oxidativen Peakpotential überwacht. Ein Schema der Redox-Reaktionen für die pH-Detektion ist in 5 gezeigt.
4. Kalibrierkurven für Glukose und Laktat-Sensoren können durch aufeinanderfolgende Zugaben von der jeweiligen Analyten erstellt werden; chronoamperometrischen Messungen werden nach jeder Analyt Neben Auftritten als in den Abschnitten 5.1 und 5.2 beschrieben. Alternativ können feste Potential chronoamperometrischen Messungen unter Rühren aber ausreichend Zeit (~ 10-100 Sekunden) zwischen den einzelnen Analyten zusätzlich zur aktuellen Stabilisierung vorgenommen werden.
5. pH Eichkurven kann durch Messung der Position des oxidativen Peakpotential über eine Reihe von bekannten pH-Werten von 5 bis 8 in Schritten von 1,0 pH-Einheiten und Aufzeichnung Cyclovoltammogramme, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben erstellt werden.

5. Vertreter ReErgebnisse

Bei der Gewinnung chronoamperometrischen Kurven (z. B. für Glucose Nachweis oder Lactat-Detektion) in ruhenden Lösungen mit folgenden modifizierten Kohlenstoff-Mikronadeln gefüllt, wird der Strom sofort nach Anlegen des jeweiligen Detektionspotential verringern. Es wird schließlich zu einem stationären Wert verfallen. Ein repräsentatives Ergebnis ist in 6 gezeigt, das Ergebnis wurde aus 2 mM Zusätze von Lactat und Aufzeichnung der Lactat Mikronadel erhalten. Die Lösung muss kurz nach jeder Zugabe gerührt Laktat werden. Die aktuelle nach 15 Sekunden nach oben steigt die Konzentration von Laktat, die aktuelle Antwort kann dann verwendet, um die Konzentration von Lactat in einer unbekannten Lösung zu bestimmen. Alternativ kann eine kontinuierliche Überwachung in einer gerührten Lösung (oder in einer fließenden Lösung) als eine Lösung mit zunehmender Glucosekonzentration (5) gezeigt verwendet werden. Auch hier erhöht die Zunahme des Stroms, der bei ter Konzentration von Glukose verwendet werden, um die Glukose als Reaktion auf eine unbekannte Lösung zu standardisieren. Es muss genug Zeit nach jeder Spike gewährt werden, um damit die Lösung zu stabilisieren. Cyclovoltammogramme an der pH-empfindliche Mikronadel in 0,1 M Phosphatpuffer auf vier verschiedene Lösungen von pH 5 bis 8, 1 pH-Einheit Schritten in 6 gezeigt. Die oxidativen Peakpotential Schichten mit zunehmendem pH-Wert; dieses Phänomen wird als ein Indikator für die pH-Wert verwendet.

1. Bilder von der STL-Datei des Mikronadelarray in Solidworks (A) und der Druck Bildschirms, wobei die Trägerstruktur (B) zeigt erstellt.

2. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Mikronadel-Anordnung (A) und einer Mikronadel in diesem Array (B).

Abbildung 3. Schematische Darstellung des Flachbandkabels Montage. Die einzelnen Schritte das Modifizieren der flachen flexiblen Kabels (A), Abtragen der gemusterten Kreisen (B), indem die zunächst abgetragen Melinex Schicht, die mit Kohlenstoff-Paste (C) gefüllt ist, sowie das Hinzufügen der zweiten Schicht und abgetragenen Melinex Zusammensetzen der Mikronadelarrays (D). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 4. Kalibrierung von Laktat-und Kleinschreibung Paste mit 15 Sekunden chronoamperometrischen Scans bei -0,15 V in 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 7,5). Jede Erhöhung des Stroms entspricht einer 2 mM Zusatz von Laktat.

Abbildung 5.

Abbildung 6. Cyclovoltammogramm (CV) der pH-sensitiven Kohlenstoff in 0,1 M Phosphatpuffer auf pH 5-8 fügen Sie in Schritten von 1 pH-Einheit (teal = pH 8,0, grün = pH 7,0, pH 6,0 = lila, rot = pH 5,0). Eine fünfte CV wurde für die Analyse gegen Ag / AgCl-Referenzelektrode und Pt-Draht Gegenelektroden verwendet.

Discussion

Mehrere Aspekte der Gestaltung dieser Mikronadel-basierten Sensor wurden als vor der Herstellung der Vorrichtung. Um diesen Sensor für die Echtzeit-Detektion verwendet, muss die Reaktion des Sensors gering; in diesem Protokoll, zeigte jede getestete Sensor eine Reaktionszeit unter fünfzehn Sekunden. Pasten im Sinne dieses Protokolls wurden auch auf ihre Selektivität in In-vivo-Umgebungen, die elektrisch aktiven Biomoleküle, die mit Elektroden-Reaktion stören können enthalten gewählt. Neben der Komposition folgenden sind die Verwaltung Potentiale gewählt, um den Einfluss störender elektroaktive Spezies zu minimieren. Erfolgreiche Herstellung der Mikronadel-Anordnung beinhaltet die Auswahl eines geeigneten Mikronadel Design und Mikronadel Material. Diese beiden Aspekte werden festzustellen, ob die Mikronadel durchstechen können die Haut, schützen die Elektroden vor physischen Beschädigungen, und schließt Elektrode-Gewebe-Berührung. Es sei darauf hingewiesen, dass eine externe Ag / AgCl und Pt beziehenschaft und Gegenelektroden wurden bei den Messungen verwendet, in vivo-Verwendung dieser Vorrichtung mit menschlichen oder tierischen Subjekten würde erfordern, dass diese Elektroden in der Vorrichtung aufzunehmen.

Jede Komponente des Mikronadel-basierten Sensor verfügt über Funktionen, validiert, um die ordnungsgemäße Funktionalität zu gewährleisten muss. Qualitätskontrolle während der Modifikation des Flachbandkabels (Abbildung 3 B) muss gewährleistet werden, dass die isolierende Schicht vollständig von der Oberfläche der verzinnten Kupferdrähten nach Laserablation (Abbildung 3) entfernt. Wird das isolierende Schicht von der Oberfläche des Kupferdrahtes nach Laserablation entfernen können zu Fehlern Antworten aufgrund der unvollständigen elektrischen Kontakt. Die laserablatierten Melinex Band muss mit einem Mikroskop, um sicherzustellen, daß der Durchmesser jeder Öffnung konsistent ist, wie es den Arbeitsbereich der Elektrode definiert untersucht werden. Bei der Anwendung von Kohlenstoff-Paste auf die laserablatierte Melinex Band Hohlräume,Die Paste muss auf die genaue Lochdurchmesser ohne Selbstbehalt entsprechen, um Signal Variationen aufgrund von Unterschieden in der Fläche zu vermeiden. Während chronoamperometrischen Messungen mit modifizierten Kohlenstoff-Pasten, muss das Signal zu einem Grenzwert zu stabilisieren, bevor Strom aufgezeichnet. Diese Ergebnisse lassen sich leicht durch Mischen von Effekten variieren. Mechanische Prüfung der Mikronadelarrays vor Sensor wurde auf Inkorporation durchgeführt; in einer früheren Studie, zeigte unsere Gruppe diese Arrays der Lage waren, Punktion Schweinehaut, das als ein analoges für die menschliche Haut gebraucht ³ Mikronadelarrays sollte nicht verformen oder Bruch während. Eindringen in die Haut seit dieser Prozesse könnte zu Schäden führen Elektrode.

Dieses Protokoll hat den Bau eines neuartigen transdermalen Vorrichtung zur elektrochemischen Überwachung detailliert. Wir stellen uns vor zukünftigen Bemühungen mit Mikronadel Sensoren mit einer noch größeren Anzahl von einzeln adressierbaren Mikronadeln und eine größere Vielfalt von transducers. Dieses Gerät wurde zur Analyse der interstitiellen Flüssigkeit beim Menschen entwickelt, die Verwendung mit Tieren ist auch möglich, mit entsprechenden Spezies-spezifische Modifikationen an Mikronadel Design. Künftige Ausrichtung mit dieser Technologie umfassen, sind aber nicht Fernüberwachung von Patienten sowie die Kopplung mit einem Medikamenten-Zufuhrvorrichtung für eine automatisierte Erkennung-Drug-Delivery beschränkt.