Summary
שיטה לטעון אזור תאי subventricular (SVZ) עם צבעי סיד חיווי לפעילות הסידן הקלטה מתוארת. SVZ לאחר הלידה מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים וneuroblasts. במקום להשתמש בטעינת אמבטיה אנו מזריקים צבע בלחץ בתוך הרקמה המאפשרת דיפוזיה צבע טובה יותר.
Abstract
אזור subventricular (SVZ) הוא אחד משני האזורים במוח neurogenic לאחר הלידה. SVZ מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים עם תכונות astrocytic (הנקרא האסטרוציטים SVZ), neuroblasts, ותאי ביניים. Neuroblasts נולד בSVZ משיק לנדוד מרחק רב כדי נורת חוש הריח, שבו הם להתמיין interneurons. איתות אינטר באמצעות מולקולות דבקות ואותות diffusible ממלאת תפקידים חשובים בneurogenesis שליטה. רבים מאותות אלו לגרום לפעילות הסידן אינטר שמעבירה מידע בתוך ובין תאים. סידן היא פעילות ובכך משקף את הפעילות של אותות תאיים והיא דרך אופטימלית להבין איתות אינטר פונקציונלית בין תאי SVZ.
פעילות סידן נחקרה באזורים רבים אחרים וסוגי תאים, כוללים תאי גליה ונוירונים בוגרים. עם זאת, השיטה המסורתית לואהתאי D עם סיד מחוון צבע (טעינת אמבטיה כלומר) לא היו יעילים בטעינה כל סוגי תאי SVZ. ואכן, בצפיפות הסלולרית SVZ מונעת התפשטות צבע בתוך הרקמה. בנוסף, הכנת פרוסות sagittal יהיה טוב יותר לשמור על ההסדר תלת הממדי של תאים, במיוחד SVZ זרם הגירת neuroblast על הציר מקורי-הזנב.
כאן, אנו מתארים שיטות להכנת סעיפי sagittal המכילים SVZ, הטעינה של תאי SVZ עם צבע מחוון סידן, ורכישת פעילות סידן עם סרטי זמן לשגות. אנחנו השתמשנו Fluo-04:00 לצבוע לטעינת האסטרוציטים SVZ באמצעות יישום לחץ בתוך הרקמה. פעילות סידן נרשמה באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה המאפשר רזולוציה מדויקת לתאים בודדים מזהים. הגישה שלנו היא ישימה לאזורים אחרים, כולל neurogenic האזור המבוגר היפוקמפוס subgranular ואזורי neurogenic עובריים. בנוסף, סוגים אחרים של צבעים יכוליםלהיות מיושם בשיטה שתוארה.
Protocol
1. הכנה של פתרונות, נתיחה, וvibratome
- פתרונות צריכים להיות מוכנים באוסמולריות והחומציות הנכונות (טבלה 1). בהשוואה לנוזל השדרתי מלאכותי (ACSF), פתרון נתיחה הוא מוכן עם ריכוזים נמוכים של נתרן וסידן, וריכוזים גבוהים של מגנזיום. זה כדי למזער תופעות excitotoxicity במהלך חיתוך.
- שני פתרוני הנתיחה וACSF חייבים להיות רוויים עם 95% O 2/5% CO 2 על ידי מבעבע במשך לפחות 10 דקות כדי להגיע לרמת החומציות הרצויה של 7.3.
- הכן קרח אמבטיה במגש. מניח צלחת נתיחה באמבט הקרח ולמלא עם פתרון לנתיחה. בועת צלחת הניתוח.
- הכן vibratome ידי יצירת קרח אמבטיה. הנח את המנה חתכה באמבט הקרח, למלא את הצלחת עם פתרון נתיחה, ובועה.
- מלא את הפרוסה מחזיקה קאמרי עם ACSF ובועה כדי להבטיח פתרון שאוורר כראוי ללא קשרמשם פרוסות ממוקמות.
2. הסרה של רקמת המוח
פרוסות מוח חריפות נוטות להיות בריאים יותר עם עכברים צעירים. הארכיטקטורה הסלולרית של אחרי לידת SVZ במכרסמים היא בוגרת סביב יום לאחר לידה (P) 20 1. לכן, אנחנו מנסים להגביל הניסויים שלנו לגילי עכבר של P20-P30 אבל אנחנו בצענו ניסויים מוצלחים בעכברים מלפני 3 חודשים. במהלך טיפול ברקמות, אחד חייב להיות זהיר כדי למזער את התנועות ולחץ למוח מכאניים, לשמור על תנאי קירור, ולחשוף SVZ לפתרון במהירות אפשרית הקורבן הבא.
- לאחר ההזרקה של פנטוברביטל, העכבר ערוף במהירות. הפרווה יוסרה וחתכים נעשים באמצעות בסיס הגולגולת. אז הראש ממוקם במגש מלא פתרון נתיחה.
- בעוד ייצוב הראש עם מלקחיים, הפחתה רציפה נעשית מסביב לגולגולת ולעתים עד קו האמצע עם microscissors. להיות זהיר, כדי להפחית את המגע עם רקמת הגוף. מאז נורת חוש הריח היא היעד הסופי של נוירונים יילוד מSVZ, צריך להיות מודע לשימור אזור זה, בעיקר בהסרת עצם סביב אזור זה. קיצוצי Microscissor נעשו מסביב לגולגולת צריכים להיות בצד הגב, כדי לאפשר הסרה קלה של הגולגולת.
- הסרה של הגולגולת שמעל המוח עכשיו מופרד מהעצמות שמתחת למוח. אם קיצוץ בשלב הקודם נעשה בצורה נכונה, עצם שמעליה זה ניתן להסיר בקלות עם פינצטה או מלקחיים.
- ועדיין מחזיק את הראש עם מלקחיים, אפשר להשתמש בסכין כירורגית נקיים כדי להסיר כמה חתיכות של רקמות מוח לפני חיתוך, כגון הבא. קיצוץ עטרה יכול להתבצע ברמה של למבדה. קיצוצי sagittal יכולים להתבצע בשני הצדדים של המוח לרוחב לSVZ. הערכה שמרנית תהיה ~ 2.5 מ"מ מקו האמצע. אם ירצה, המוח יכול להיות גם התפצל לפתע כאן. קיצוצים אלה הם facilitate הרכבה של הרקמות ולאפשר SVZ אליו יש להגיע במהירות רבה יותר כאשר מוח חיתוך. חשוב לזכור להפעיל את הכמות המינימאלית של כוחות מכאניים על המוח (למשל לא דוחף או מושך).
3. הכנה פורסת מוחית חריפה
- כדי להתכונן לשלבים באים, ודא שהדבק סופר נהג לעלות רקמות הוא ללא כפכפים ומוכן לפנות לצלחת vibratome. חשוב ללכת מהר ככל האפשר מבלי לפגוע במוח.
- רקמת המוח אז יכולה להיות גרפה מתחת, שמפריד את הרקמה מעצם שמתחת תוך הפרדת עצבים.
- הרקמה היא רכובה והדביקה על צלחת והניחה על vibratome. בשל האנטומיה מקורית-הזנב של SVZ, אנו מתמקדים בהפיכת פרוסות sagittal כפי שהוא שומר על מסלול הנדידה של neuroblasts, נדן גליה, ומערכת כלי דם שמיושרים במידה רבה בכיוון זה. פחית אחת או מוUNT הרקמה בקו האמצע או על המשטח השטוח שנוצר על ידי ביצוע חתכים רוחביים לSVZ sagittal. שלב אופציונלי הוא להציב 3% בלוק agarose מאחורי הרקמה לשמש משען ללהב כפרוסות יורדות. אנחנו השתמשנו דבק סופר cyanoacrylate מבוסס מועדפים.
- יש לשטוף את הלהב עם אתנול להסיר שמנים ולשטוף עם מים מזוקקים. מניח את הלהב על מחזיק הלהב. הר מחזיק הלהב לvibratome.
- התאם את גדרות vibratome לחתוך רקמות בעובי של 250-350 מיקרומטר לפרוסה. חשוב לחתוך באמצעות תנודות בתדירות גבוהות ומהירות נמוכה.
- סעיף הדרגה דרך הרקמות. המראה של נורת חוש הריח הוא אינדיקטור טוב שאחד הוא קרוב SVZ בפרוסות sagittal כמו הפרוסות הרוחביות ביותר תכלנה גם אזור. ציוני דרך אחרים לחפש כוללים את החדר והעיבוי של כפיס המוח, שמתחתיו SVZ ממוקם. SVZ יהיה ראשון להופיע בשגייה רוחבית יותרפרוסות טל. RMS יציג בפרוסות sagittal המדיאלי.
- הסר פרוסות המכילות SVZ עם פיפטה פסטרה פלסטיק עם הקצה חתוך. העברה לתא אחזקת הפרוסה. לעתים קרובות אנו משיגים עוד פרוסות ממה שאנחנו יכולים להשתמש ביום עבודה. עם זאת, פרוסות תשתנינה בכמות תאים המכילים SVZ. לעתים יש צורך להסתכל דרך כמה פרוסות למצוא אחד רצוי להדמיה.
4. הכנה של מיקרוסקופ וצבעים
את הפרוסות דורשות זמן דגירת שעה אחת בACSF להתאושש מהנתיחה והחיתוך. ניתן לבצע כמה צעדים במהלך תקופת החלמת פרוסה זה.
- הכנת pipettes לצבע סיד ו / או יישום תרופה
- pipettes זכוכית צריך טיפ של 2-3 מיקרומטר בקוטר ואורך קצה (~ 2 מ"מ) וזווית (~ 16 ° לבעל פיפטה) המונעת מגע עם תא זלוף ומאפשר מקום להשמההאובייקטיבי.
- בדרך כלל אחד יכול להכין 6-8 pipettes לחץ עבור כל יום של ניסויים.
- הכנת צבע סיד
- כאשר מתכוננים פתרון עובד (4-5 מיקרומטר על ידי אמבטיה, 250 מיקרומטר ידי יישום לחץ), הדרך טובה ביותר היא לחשוף את הסכום המינימאלי של DMSO לתאים. זו יכולה להיות מושגת על ידי הפיכת מניות מרוכזות מאוד. לדוגמה, עבור Fluo-4, צינור אחד המכיל 50 מיקרוגרם משמש ליום. אפשר להפוך את מניית 10 מ"מימ של aliquot זו על ידי הוספת 4.6 μl של פתרון ה-F-127 20% Pluronic בDMSO.
- הכנת התקנת מיקרוסקופ (איור 2).
- שימוש במשאבת peristaltic לזרימת פתרון סייע למזער את סחיפת תמונה. הפעלת משאבת peristaltic לפני לאפשר ACSF לרוץ דרך קווי זלוף ולוודא שהוא נקי מבועה.
- הגדר את כניסת הצינור בתא זלוף ולוודא שאין נזילות.
- מקם את קצה הוואקום לensיור שהפתרון הוא להיות aspirated מתא זלוף. לוודא שהוא ברמה נאותה, כך שהמטרה היא שקועה במרחק העבודה הנכון, אבל לא כל כך גבוהה, שהפתרון כזה עשוי לשפוך על התא. רמה נמוכה של פתרון תהיה גם לצמצם עיוותי זרימה. שאיפה מתמדת יכולה גם להיות מאומתת על ידי הקשבה ליציבות.
5. דאה טוען
שיטה זו תוארה בפירוט בכתב יד אחרת 2. אנא ראה דמויות בו.
- לצבוע טעינת אמבטיה
- הפוך פתרון עובד 1-2 מ"ל של הצבע. לFluo-4 בבוקר, ריכוז מיקרומטר 4-5 הוא נאות לתיוג neuroblasts SVZ.
- פרוסות מועברות תחילה לצלחת תרבות 35 מ"מ עם תחתית רשת שכבר מלאה ACSF. החלף את הפתרון באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 3 מיליליטר עדינות להסיר ACSF, תוך הוספת גalcium לצבוע עובד פתרון.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות ב5% 2 CO גז סביבה מבוקרת.
- הנח פרוסה בחזרה לתא מחזיק ACSF המלא כדי לשטוף את הצבע שלא נכנס תאים. לחלופין, אפשר למקם אותו ישירות על תא זלוף מיקרוסקופ שבו פועל ACSF. תקופה זו היא לשטוף 30-45 דקות.
- להעביר את הפרוסה לתא זלוף.
- יישום לחץ של צבע
- להעביר את הפרוסה מהתא לתא מחזיק זלוף על התקנת מיקרוסקופ.
- מלא כוס טפטפה עם פתרון עובד שהוא 250 מיקרומטר ומניחים על micromanipulator.
- מנמיך את הפיפטה לאזור של עניין. פיפטה יכולה להיות ממוקמת באופן שהקצה הוא גם מיקרומטרים אחדים מעל פני השטח הפרוס או נקבר מיקרומטרים אחדים מתחת לפני שטח הפרוסה, אך הרחק מהאזור המוקלט. הזווית של פיפטה לא affect יעילות הטעינה. כאשר הדמיה מתחת לפני שטח הפרוסה, אנו מוצאים כי הצבת קצה פיפטה מתחת למטוס ההדמיה לתייג אזור ההדמיה הרצויה לנו טובה יותר.
- כאשר לחץ החלת הצבע, להגדיר Picospritzer כך שהוא <3 psi. יש לנו לא העריך את עוצמת הקול של דיפוזיה צבע, כי זה נתון לשונות של קוטר טיפ פיפטה, לחץ, וצפיפות של רקמה שבי הצבע מוזרק. אנו מיישמים פשוט עד שנשיג הטעינה הרצויה לנו כפי שהוערך על ידי עין. למזער את הניזק לפרוסה במהלך יישום, במיוחד כאשר הקצה ממוקם מתחת לפני שטח הפרוסה. מועמדות 1-2 דקות. יישומים חוזרים ונשנים לפעמים נחוצים בהתאם לתיוג כפי שהוערך על ידי עין. עבור משך זמן ריכוז ויישום זה, אנו מוצאים כי יישום פני שטח של צבע מועדף מתייג neuroblasts בעוד שמתחת לפני שטח היישום מעדיף מתייג האסטרוציטים. עם זאת,> יישום 3 דקות ב 500 מיקרומטר גם לתייג neuroblastsבין אם הקצה הוא מעל או מתחת לפני שטח הפרוסה (JC פלטל, תצפית לא פורסם). הרשה לכביסה והתאוששות פרוסה ל30-45 דקות.
6. הדמית confocal של פעילות סידן
- מצא את האזור של העניין ראשון עם מטרה בהספקים נמוכים כגון 4x או 10x. הנח במרכז השדה לפני שעבר למטרת כוח עליון. בנקודה זו, ניתן להעריך את הבריאות כללית על ידי ציון פרוסת המראה של תאי SVZ תחת לעומת פער התערבות (DIC). תאים בריאים מופיעים עגולים ושמנמנים. בנוסף, תאים בריאים יציגו-4 Fluo טעינה קלושה כאמורים אין טעינה בכלל או בהיר פלואורסצנטי (תא שמת).
- מנמיך את מטרת הטבילה במים על האזור של עניין, שהוא עכשיו לצבוע טעון. כך או אובייקטיבי 40X או 60x כבר מספיק לצרכימים שלנו, למרות ש40X מספק שדה רחב יותר של נוף ומאפשר גישת פיפטה גדולה יותר. כאשר הדמיה מתחתפני שטח, לעתים קרובות אנו הולכים לפחות 15 מיקרומטר מתחת לפני שטח הפרוסה שבו הארכיטקטורה 3-dimentional ובריאות תא נשמרים טובה יותר.
- ודא כי זלוף וואקום עובדים כראוי.
- התקנת המיקרוסקופ, כך שרזולוצית זמן לשגות ורזולוציה מרחבית מוגדרות לשיעורים רצויים. למיקרוסקופיה confocal, גורמים אלה חייבים להיות מאוזנים כעלייה ברזולוציה של זמן גורם בדרך כלל לאובדן של רזולוציה מרחבית בשל אופי הסריקה של המערכת. לפעילות סידן, שצלמנו בערך כל פריים שני עם רזולוצית 512x512 פיקסלים. אם מספר ערוצים שנרכשו בנפרד נחוצים, זה ישפיע גם על מחירי רכישה. הגדרת משך זמן של סרט (2-10 דקות).
- ליזום לרוץ. אם ביצוע מחקרים פרמקולוגיים, לשטוף ביריבים או אגוניסטים הלא להקהות רגישויות לפחות 5-10 דקות, ולאחר מכן להפוך את סרט אחר של 5-10 דקות. אגוניסטים שעשויים להפחית רגישות הקולטנים יכולים להיות מיושמים בחריפות, כגון באמצעות יחסי ציבורessure פיפטה שליטת micromanipulator.
7. ניתוח סידן
ניתוח כדלקמן נהלים סטנדרטיים שתוארנו בפרסומים עבירים 2-4. F 0 (כלומר בסיס) ו-F הם בהתאמה עוצמות הקרינה הממוצעות שנמדדו לאורך כל האזורים של עניין (Rois) והחזר השקעה בכל אחד,. שינוי בפלואורסצנטי נחשב לCa 2 + עלייה אם זה היה> 15% F / F 0 עלייה. 2 שינויים תאיים + Ca חושבו באמצעות Calsignal 5.
8. נציג תוצאות
הצלחנו להשיג טעינה סלקטיבית של תאי SVZ בהתאם לפרוטוקולי טעינת הצבע שתוארו לעיל ובמקומות אחרים 2-4,6. טעינת אמבטיה או יישום לחץ על משטח פרוסת Fluo-04:00 (4-5 או 250 מיקרומטר, בהתאמה) התוויות בעיקר neuroblasts. בעוד יישום לחץ יכול לטעון neurobנמשך מהר יותר מטעינת אמבטיה בפרוסה אחת, טעינת אמבטיה מאפשרת טעינה בו הזמנית של מספר פרוסות. אנו מאשרים את זהותו של תאים שכותרתו כneuroblasts ידי (1) אם הם מציגים התנהגות נדידה 4,7, (2) המורפולוגיה שלהם, (3) מכתים שלילי של sulforhodamine 101, צבע astrocyte ספציפי 3 או (4) צביעה החיובית עם ביטוי DCX-DsRed (JC פלטל, תצפית לא פורסם). Neuroblasts להעביר במהירות (ממוצע של 60 מיקרומטר / שעה) בטמפרטורה פיזיולוגית 4,7-9, אבל התנועה שלהם יכולה להיות בקלות נצפתה גם בטמפרטורת חדר. התנועה של neuroblasts אינה מהווה בעיה בכל קשור להצבת אזורים-של אינטרס (ROI) כדי לעקוב אחר פעילות סיד מאז הסרטים שלנו הם בדרך כלל קצרים בזמן. עם זאת, במשך תקופות ארוכות המתינו, כמו במהלך חילופי פתרון תרופתי, חוקרים צריכים להיות זהירים כדי להתאים Rois בשליטה ותקופות טיפול. אין זה נדיר עבור neuroblasts לנדוד פנימה או החוצה מאני תחום maging או מוקד מטוס.
יישום לחץ של Fluo-04:00 (250 מיקרומטר) עמוקים לתוך הפרוסה ולתקופה מוגבלת (<2 דקות) מעדיף מתייג SVZ האסטרוציטים 2. תיוג astrocyte אומת על ידי תיוג חיובי עם sulforhodamine 101 והמורפולוגיה שלהם, בעיקר על ידי הנוכחות של תחזיות וendfeet על כלי דם שתארנו 3 לאחרונה. שימוש בשיטות אלה, יש לנו נצפו פעילות ספונטנית בשניהם neuroblast SVZ ואוכלוסיית astrocyte (איור 1). הפעילות בהאסטרוציטים לעתים לובשת צורה של גלים העוסקים 3 כלי דם. יתר על כן, באמצעות הדמית סידן כassay, היישום של אגוניסטים התרופתיים גילה או אשר ביטוי של GABA A קולטנים על neuroblasts והאסטרוציטים 6, AMPA וקולטני NMDA על neuroblasts 4.
דמויות
1 "src =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
איור 1. הפצת פעילות הסידן בהאסטרוציטים. () נציג ממוצע תמונה מהקלטת הזמן לשגות פעילות הסידן. האסטרוציטים ב SVZ היו עמוסים ביישום לחץ של Fluo-4:00 עמוקים לתוך הפרוסה. סרטים נרכשו ב 0.75 בזמן של צעדים. אזורים של עניין (ROI) מונחים על תאים מציגים פעילות. (ב) עקבות מRois מונחות על תאים מהסרט המצויר ב(). עקבות סוננו עם ממוצע נע ומנורמל. הסולם האנכי מייצג 2 x ΔF / F 0 כאשר F הוא עוצמת האות וF 0 הוא האות הבסיסית הממוצעת וΔF = FF 0.
איור 2. התמונה של מערכת זלוף. קצה אחד של צינור שקוע ב95% O 2/5% CO 2 גז-pפתרון erfused. אז הפתרון הוא perfused דרך הצינור ולחדר האמבטיה על ידי משאבת peristaltic (לא מוצג). הקצה השני מוכנס לתוך מפרצון הפתרון של חדר האמבטיה רכוב על פלטפורמה. אז טיפ השאיפה מחובר לשקע הפתרון של החדר ונקבע ברמה כדי לקבוע את גובה פתרון. מהשקע, קצה השאיפה מחובר לקו הוואקום, שaspirates הפתרון מהחדר למכל אשפה. מערכת זלוף מוצגת מבמת מיקרוסקופ לבהירות חזותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמית סיד של תאי SVZ נעשתה שימוש כדי ללמוד את הדפוסים בפעילות ספונטנית בneuroblasts 10, ערוץ ביטוי הקולטן בשני neuroblasts והאסטרוציטים 4,6,8 וגלי סיד astrocytic 3. מאחר ותאים בSVZ הם או לא בוגרים או בעלי תכונות גליה, הם לא יירו פוטנציאלי פעולה 11,12, כלומר שינויים באלפית שני פוטנציאל מתח המעידים על פעילות ברשתות בוגרות אינם ישימים באזור זה. לכן, הלוכד את הסידן אירועים האיטיים יותר (על סדר שניות) היא לא רק מבחינה ביולוגית משמעותי, אבל אולי צורה הרלוונטית ביותר לפעילות בתאים אלה.
חוקרים צריכים להיות מודעים לצעדים רבים בהליך זה, במיוחד בכל קשור לבריאות פרוסה. ביצוע לא נכון של פתרונות, מים באיכות ירודה (המשמש לפתרונות) נתיחות, איטיות ולא מדויקות, והשימוש בסכיני גילוח מלוכלכים לחתוך רקמות יכולה כל יש EF מזיקfects על פעילות.
בכל קשור לשימוש באינדיקטורים סידן, בעוד אנו משוחחים על השימוש בFluo-04:00 בלבד, יש לנו ניסינו צבעים מסחריים אחרים, כולל אורגון גרין BAPTA-AM, שיש לו רמה גבוהה יותר מנקודת התחלת העמסת Fluo-4. אנחנו בחרנו להתמקד בFluo-4 בגלל הטווח הדינמי הגדול יותר שלו בהשוואה לצבעים אחרים, אבל חוקרים אחרים עשויים למצוא יתרון צבעים שונים למטרותיהם. כל צבע יכול להיות זיקה שונה לסוגי תאים מסוימים. ריכוזיות ושיטה של טעינה עשויה צריכות להיות מותאמות לכל צבע. אנחנו מעדיפים להשתמש בלחץ הטעינה לתייג האסטרוציטים SVZ ותאים בריאים, עמוקים יותר. גורם כלכלי שיש לשקול הוא שהשימוש ביישום לחץ הוא יקר יותר מיישום אמבטיה, למרות שהפתרון לצבוע בפיפטה הלחץ אפשר להקפיא ולעשות שימוש חוזר ביום למחרת. לחלופין, אינדיקטורים גנטיים מקודדים סיד (GECIs), כגון GCaMP3, היו פופולריים יותר ויותר ללימוד מערכות וחזייה אחרותבאזורי 13,14. GECIs אלה יש את היתרון של להיות מונעים על פי מקדמי תא ספציפיים, אבל קינטיקה שלהם והטווח דינמי הן בדרך כלל לא יותר טובות מהצבעים האורגניים 15. השימוש שלהם בSVZ לאחר הלידה דורש גם תיוג נגיפי או electroporation של המבנה, שהאחרון הגבלת מחקר של neuroblasts לתקופת היילודים עקב אובדן של פלסמיד במהלך חלוקת תא.
סחף פרוסה מונע רכישת אות אמינה במהלך משך הסרט והוא אחד המכשולים הטכניים המאתגרים ביותר עם ניסויים חייה הדמיה של פרוסות מוח. היא מושפעת ממספר גורמים, כוללים שיעור זלוף, שמת ואקום, משקל מטרה, ואם יש צורך, הדרגתית בטמפרטורה. אם טמפרטורות יותר מ 25 מעלות צלזיוס הם הכרחיים לניסויים, צריך לנסות לחמם פתרונות ותאי זלוף בטמפרטורה הנמוכה ביותר שבו הם יכולים לענות על השאלות שלהם מאז טמפרטורות עלולות להוביל למשמעותיים, uסחף המוקד ndesired. מחממים אובייקטיביים ומארזים מחוממים יכולים גם לסייע למזער את האפקט הזה, למרות שיש לנו ניסינו לשעבר ללא הצלחה רבה.
חסימת המכשולים הטכניים הללו, יש לחוקרים הזדמנות לבדיקה מספר רב של תאים באזור מתפתח לאחר לידה. זה מציג את ההזדמנות כדי לטפל בפעילות ברמת אוכלוסייה, שיכול להניב תובנה חדשות על תהליכי ויסות neurogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (DC007681, א.ב.), CT תאי גזע המענק (א.ב.), פארדי היסוד (א.ב.), Predoctoral רות ל Kirschstein שירות מחקר של הפרסים הלאומיים (NRSA) (SZY), ובוגר NSF מחקר מלגה (BL). אנו מודים לחברי מעבדת Bordey על הערות מועילות על כתב היד. החומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת בחלקו על ידי מדינת קונטיקט במסגרת התכנית לקונטיקט לתאי הגזע למחקר המענקים. התוכן שלה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצג בהכרח את עמדתה הרשמית של מדינת קונטיקט, המחלקה לבריאות ציבור של מדינת קונטיקט או CT חידושים, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
