カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製
Summary
記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。
Abstract
脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の2つの神経原性のゾーンの一つである。 SVZは、アストロサイトの機能（SVZアストロサイトと呼ばれます）、神経芽細胞、中間前駆細胞と神経前駆細胞を含む密集した細胞などを持っている。 SVZで生まれた神経芽細胞は接線方向に、彼らは介在ニューロンに分化する嗅球への偉大な距離を移行します。接着分子と拡散信号を介して細胞間のシグナル伝達はニューロン新生の制御において重要な役割を果たしている。これらの信号の多くは、細胞の内側との間で情報を伝達する細胞内カルシウム活性を誘発する。カルシウム活性は、細胞外シグナルの活性こうして反射性であり、SVZ細胞間の機能的な細胞間シグナル伝達を理解するための最適な方法です。
カルシウム活性は成熟したアストロサイトとニューロンを含む他の多くの地域との細胞型で研究されている。しかし、LOAに伝統的な方法カルシウムインジケーター色素（ すなわち浴ローディング）とdの細胞はすべてSVZ細胞型をロードするには効率的ではありませんでした。実際、SVZにおける細胞密度は、組織内部で染料拡散を妨げる。また、矢状スライスを準備した方が特にSVZ細胞、吻側 – 尾軸の神経芽細胞の移行の流れの3次元配列を保持します。
ここでは、SVZ、カルシウムインジケーター色素とSVZ細胞の読み込みや、タイムラプスムービーカルシウム活性の買収を含む矢状切片を作製するための方法を説明します。私達はのFluo-4を使用した組織内部の圧力アプリケーションを使用して、SVZアストロサイトをロードするための染料AM。カルシウム活性には、識別のための個々の細胞のための正確な分解能を可能走査型共焦点顕微鏡を用いて記録した。我々のアプローチは、成人の海馬下帯や胚神経性ゾーンを含む他の神経性のゾーンに適用されます。また、染料の他の種類のことができます記載された方法を使用して適用する。
Protocol
Discussion
SVZ細胞のカルシウムイメージングは、神経芽細胞10、両方の神経芽細胞およびアストロサイト4,6,8とアストロサイトのカルシウム波3受容体チャネル発現における自発活動のパターンを研究するために使用されています。 SVZにおける細胞はどちら未熟であるか、またはグリア特性を持っているので、彼らは成熟したネットワークでの活動を示す電位におけるミリ秒の変…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（DC007681、AB）、CTの幹細胞助成（AB）、パーディー財団（AB）、博士号を取得する前のルース·L·キルシュシュタイン国立研究サービス賞（NRSA）（SZY）、およびNSFの大学院研究からの補助金によって支えられてフェローシップ（BL）。我々は、原稿上の有益なコメントをBordey室のメンバーに感謝します。本材料は、部分的にコネチカット幹細胞研究助成金プログラムの下コネチカット州によってサポートされた仕事に基づいています。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもコネチカット州の公式見解を示すものではない、コネチカットやCTイノベーションの州の公衆衛生省は、株式会社。
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
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