Summary
記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。
Abstract
脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の2つの神経原性のゾーンの一つである。 SVZは、アストロサイトの機能（SVZアストロサイトと呼ばれます）、神経芽細胞、中間前駆細胞と神経前駆細胞を含む密集した細胞などを持っている。 SVZで生まれた神経芽細胞は接線方向に、彼らは介在ニューロンに分化する嗅球への偉大な距離を移行します。接着分子と拡散信号を介して細胞間のシグナル伝達はニューロン新生の制御において重要な役割を果たしている。これらの信号の多くは、細胞の内側との間で情報を伝達する細胞内カルシウム活性を誘発する。カルシウム活性は、細胞外シグナルの活性こうして反射性であり、SVZ細胞間の機能的な細胞間シグナル伝達を理解するための最適な方法です。
カルシウム活性は成熟したアストロサイトとニューロンを含む他の多くの地域との細胞型で研究されている。しかし、LOAに伝統的な方法カルシウムインジケーター色素（ すなわち浴ローディング）とdの細胞はすべてSVZ細胞型をロードするには効率的ではありませんでした。実際、SVZにおける細胞密度は、組織内部で染料拡散を妨げる。また、矢状スライスを準備した方が特にSVZ細胞、吻側 - 尾軸の神経芽細胞の移行の流れの3次元配列を保持します。
ここでは、SVZ、カルシウムインジケーター色素とSVZ細胞の読み込みや、タイムラプスムービーカルシウム活性の買収を含む矢状切片を作製するための方法を説明します。私達はのFluo-4を使用した組織内部の圧力アプリケーションを使用して、SVZアストロサイトをロードするための染料AM。カルシウム活性には、識別のための個々の細胞のための正確な分解能を可能走査型共焦点顕微鏡を用いて記録した。我々のアプローチは、成人の海馬下帯や胚神経性ゾーンを含む他の神経性のゾーンに適用されます。また、染料の他の種類のことができます記載された方法を使用して適用する。
Protocol
1。溶液の調製、解剖、およびビブラトーム
- ソリューションは、正しい容量オスモル濃度とpH（ 表1）で準備しなければなりません。人工脳脊髄液（ACSF）に比べて、解剖溶液はナトリウムとカルシウムの濃度が低いと、マグネシウムの高い濃度で調製される。これは、スライス時の興奮毒性の影響を最小限にすることです。
- 両方の解剖とACSFソリューションは、7.3の所望のpHに達するためには、少なくとも10分間バブリングすることにより95％O 2/5％CO 2で飽和されなければならない。
- トレイに氷浴を準備します。氷浴中で解剖プレートを置き、解剖液で埋める。バブル解剖プレートを。
- 氷浴を作成することにより、ビブラトームを準備します。氷浴中でセクショニング皿を置き、解剖ソリューション、およびバブルと皿を埋める。
- その解決策が適切に関係なく通気されるようにACSFとバブルとスライス保持チャンバーを埋めるスライスを配置する場所の。
2。脳組織の除去
急性脳スライスは、若いマウスと健康的になる傾向があります。げっ歯類では生後SVZの細胞構造は、生後（P）は20 1の周りに成熟しています。そこで我々は、P20〜P30のマウスの年齢に我々の実験を制限しようとするが、我々は3ヶ月と同じくらい古いマウスで成功した実験を行った。組織の取り扱いを通して、一つは、機械的な動きと、脳への圧力を最小限に冷却条件を維持し、ソリューション、できるだけ早く次の犠牲にSVZを公開するために忘れてはならない。
- ペントバルビタールの注入後、マウスが急速に断頭されています。毛皮が削除され、切開が頭蓋底を介して行われます。ヘッドは、解剖溶液を満たしたトレーに置かれます。
- 鉗子で頭を安定させ、連続的なカットが頭蓋骨の周りに作られており、時にはmicroscと正中線までissors。組織との接触を最小限にするように注意してください。嗅球は、SVZから新生ニューロンの最終目的地であるので、1は、特にこの地域の周りの骨除去の際に、その領域を維持に留意する必要があります。頭蓋骨の周りに作られMicroscissorカットは頭蓋骨を簡単に削除できるようにするために、背側に配置する必要があります。
- 脳を覆う頭蓋骨の除去は今では脳の下の骨から分離されている。前の手順でカットが正しく行われている場合は、この上を覆う骨はピンセットや鉗子で容易に除去することができる。
- まだ鉗子で頭を押さえながら、1は、次のような、きれいにスライスする前に脳組織のいくつかの部分を除去する外科用ブレードを使用することができます。コロナのカットはラムダのレベルで行うことができます。矢状カットは、SVZに横脳の両側で行うことができます。控えめな見積もりでは、正中線から〜2.5ミリメートルであろう。必要であれば、脳もここhemisectedすることができます。これらのカットは両方FACILます組織の取付けitateと脳がスライシング時SVZをより迅速に到達することができます。脳（ 例えば、押したり引いせず）上に機械的な力の最小量を発揮することを覚えておくことが重要です。
3。急性脳スライス標本
- 後続のステップの準備をするために、組織をマウントするために使用するスーパー接着剤は下駄の無料ビブラトームプレートに適用する準備ができていることを確認してください。脳に損傷を与えることなく、できるだけ早く行くことが重要である。
- 脳組織は、同時に神経を分離しながら下層の骨由来の組織を分離して下から掬いすることができます。
- 組織がマウントされており、板の上に接着され、ビブラトーム上に配置されます。 SVZの吻側 - 尾解剖のために、我々はそれは神経芽細胞の移動経路、グリアシース、及び主にこの方向に整列している血管系を保持としてサジタルスライスすることに力を注いできた。一つは、MOのいずれかを行うことができ正中線で、または、SVZに横サジタルカットすることによって作成された平らな面の上にティッシュをUNT。オプションのステップではスライスが降りる時、ブレードへのアバットメントとして機能する組織の背後に3％アガロースブロックを配置することです。我々は、優先的にシアノアクリレート系瞬間接着剤を使用していました。
- 油を除去し、蒸留水ですすぎ、エタノールで刃をすすぐ。ブレードホルダーに刃を配置します。ビブラトームにブレードホルダーをマウントします。
- スライス当たり250から350μmの厚さで組織を切断するビブラトーム設定を調整します。高周波振動と低速を用いて切断することが重要です。
- 徐々に組織を介して参照してください。嗅球の外観はほとんど横スライスがどちらの地域が含まれていますように1つはサジタルスライスでSVZそばにいることを示す良い指標である。を探すために他のランドマークは、SVZが配置されている下に心室と脳梁の肥厚などがあります。 SVZはもっと横sagitに最初に表示されますTALスライス。 RMSは内側矢状スライスに表示されます。
- 先端が切れてプラスチック製パスツールピペットを用いて、SVZを含むスライスを削除します。スライス保持チャンバーに移す。我々はしばしば、仕事の日で使用できるよりも多くのスライスを取得する。しかし、スライスはSVZを含有する細胞の量に変化します。それは、イメージングのための希望を見つけるためにいくつかのスライスに目を通す必要がある場合があります。
4。顕微鏡と染料の調製
スライスは、解剖やスライスから回復するACSFで1時間のインキュベーション時間を必要とします。いくつかのステップは、このスライスの回復期間中に実行できます。
- カルシウム染料および/または薬物アプリケーション用ピペットの作製
- ガラスピペットは、直径と灌流チャンバーとの接触を防止し、配置するための部屋を可能先端長さ（約2mm）と角度（ピペットホルダー用〜16℃）で2〜3μmの先端を持っている必要があります客観的。
- 一つは、通常の実験の各曜日の6月8日圧力ピペットを準備することができます。
- カルシウム染料の準備
- 実用的なソリューションを（バスで4から5μM、250μMの圧力印加による）を調製するとき、それは細胞にDMSOの最低額を公開するのが最善です。これは、高度に濃縮された株を作ることによって達成することができる。たとえば、Fluo-4を、50μgを含む1管は日ごとに使用される。一つは、DMSO中プルロニックF-127の20％溶液4.6μlを添加することによって、このアリコートの10mMストックを作ることができます。
- 顕微鏡のセットアップ（ 図2）を作製した。
- 溶液の流れのための蠕動ポンプを使用するには、イメージのずれを最小限に抑える助けた。 ACSFは灌流ラインを介して実行し、それは無気泡であることを確認できるようにする前に、蠕動ポンプを実行します。
- 灌流チャンバーにチューブ入口を設定し、漏れがないことを確認してください。
- ENSにバキュームチップを置き溶液が灌流チャンバーから吸引されていることをURE。それは目的が適切な作動距離に浸漬し、そのようなその解がチャンバーの上にこぼれることがそれほど高くないように、十分なレベルであることを確認します。ソリューションの低レベルはまた流れの歪みを最小限に抑えることができます。一定の吸引も安定をリッスンすることによって確認できます。
5。色素ローディング
このメソッドは、別の原稿2に詳細に記載されています。そこの図を参照してください。
- バースのローディング色素
- 染料の1〜2ミリリットル作業溶液を作る。のFluo-4 AMの場合は4-5μMの濃度は、SVZの神経芽細胞を標識するための十分です。
- スライスは、まず既にACSFで満たされているメッシュ底を35mm培養皿に移しています。同時にCを添加しながら、そっとACSFを削除するには、3ミリリットルプラスチック製のピペットを使用してソリューションを交換してくださいalcium色素はワーキング溶液。
- 5％のCO 2ガスを制御されている環境で30〜60分間37℃でインキュベートする。
- セルを入力していない染料を洗い流すACSF満ちた保持チャンバーに戻しスライスを置きます。あるいは、一つはACSFを実行している顕微鏡灌流チャンバーに直接置くことができます。この洗浄期間は30〜45分です。
- 灌流チャンバーにスライスを転送します。
- 染料の加圧
- 保持室から顕微鏡のセットアップ上の灌流チャンバーにスライスを転送します。
- マイクロマニピュレータ上の250μmと場所です作業溶液をガラスピペットを埋める。
- 関心領域にピペットを下げます。ピペットは先端が離れて記録された領域からいずれかのスライス表面下数μmのスライス面上または埋葬数μmであるが、あるように配置することができます。ピペットの角度はaffeませんでしたCT積載効率。スライス面下イメージングは、我々は、結像面下にピペットチップを配置することにより、よりよい私達の希望の撮像領域にラベルを付けることを見つけたとき。
- それは<3 psiであるように、染料を適用する際の圧力は、Picospritzerを設定します。これはピペット先端径の変動、圧力印加され、色素が注入される組織の密度を受けることがあるので、我々は、色素拡散の量を推定していない。目で評価されるように私達が私達の希望のローディングを実現するまで、我々は単に適用されます。先端がスライス面の下に配置されている場合は特に、アプリケーション間、スライスへのダメージを最小限に抑えることができます。 1〜2分間適用されます。ときどき繰り返さアプリケーションは目によって評価されるラベルに応じて必要である。この濃度およびアプリケーション持続のために、私たちは表面アプリケーションの下に優先的にアストロサイトにラベルを付けながら、染料の表面アプリケーションが優先的に神経芽細胞をラベル付け見つける。しかし、500μMの> 3分のアプリケーションはまた、神経芽細胞にラベルを付けますかかわらず、先端が上または下にスライス面（JC Platel、未発表データ）であるかどうか。 30から45分間洗浄し、スライスの回復を可能にします。
6。カルシウム活性の共焦点イメージング
- 4xまたは10xのような低消費電力の目標を持つ最初の関心領域を見つけます。高い電力目標に切り替える前に、フィールドの中央に置きます。この時点で、1は微分干渉コントラスト（DIC）の下SVZ細胞の出現に注意することによって、一般的なスライスの健全性を評価することができます。健康な細胞は丸くふっくら見える。すべてまたは明るい蛍光（瀕死細胞）で無負荷になってとしてだけでなく、健康な細胞にはかすかなのFluo-4ロードが表示されます。
- 今色素ロードされ、関心領域、上に、水浸対物レンズを下げます。 40Xは、より広い視野を提供し、大きいピペットへのアクセスが可能になるが、どちら40Xまたは60Xの目的は、我々のニーズに十分であった。場合は、以下のイメージング表面、私たちはしばしば、少なくとも15μmの3次元アーキテクチャと細胞の健康状態が良く保存されているスライス面の下に行く。
- 灌流と真空が十分に機能していることを確認します。
- その時間経過の分解能と空間分解能が所望の速度に設定されているので、顕微鏡をセットアップします。共焦点顕微鏡は、これらの要因は、通常、システムのスキャンの性質のために空間分解能の損失をもたらす時間分解能の増加としてバランスをとらなければならない。カルシウム活性のために、私たちは512x512ピクセルの解像度を持つ、およそ毎秒フレームをイメージしています。別途取得した複数のチャネルが必要な場合は、これも取得率に影響を与えます。映画（2-10分）の継続時間を設定します。
- 実行を開始します。薬理学的研究を行っている場合は、少なくとも5〜10分間拮抗薬または非不感アゴニストで洗浄した後、5〜10分の別の映画を作る。受容体を脱感作することがアゴニストが急性PRなどを使って、適用することができますマニピュレーターによって制御ピペットをessure。
7。カルシウムの分析
分析は、我々は透水性の出版物2-4に記載されている標準的な手順に従います。 F0（ すなわちベースライン）とFはそれぞれ、関心領域のすべて（ROIの）全体と各ROIの測定された平均蛍光強度である。蛍光の変化は、それが> 15％、F / F 0増加した場合、Ca 2 +の増加があると考えられた。細胞内Ca 2 +の変更がCalsignal 5を用いて計算した。
8。代表的な結果
我々は、上記の他の場所2-4,6説明色素ローディング·プロトコルに応じてSVZ細胞の選択的負荷を得ることができた。ほとんどのFluo-4 AM（それぞれ4月5日または250μM）、ラベル神経芽細胞のスライス面上のバースのローディングまたは加圧。圧力アプリケーションがneurobを読み込むことができますがより迅速に単一のスライスでお風呂·ロードより続く、バス負荷が複数のスライスの同時読み込みが可能になります。我々は、彼らが移動行動4,7、（2）それらの形態、ローダミン101の（3）ネガティブ染色、アストロサイト特異的色素3または（4）陽性染色とを表示するかどうか（1）神経芽細胞などの標識された細胞の同一性を確認DCX-DsRedを発現（JC Platel、未発表データ）。神経芽細胞は、生理的温度で4,7-9（60μmの平均/ hr）を迅速に移行するが、その動きは容易に室温でも観察することができます。神経芽細胞の移動は、私たちの映画が期間中に一般的に不足しているので、カルシウムの活動を追跡するために地域の関心（ROI）を配置することに関して問題をもたらすことはありません。しかし、このような薬液交換時などの待機期間の長さ、中には、捜査官は、制御および治療期間でROIを一致させるように注意する必要があります。神経芽細胞は、iにまたはの外に移動することは珍しいことではありません magingフィールドまたは焦点面。
深いスライスにし、限られた期間（<2分）用のFluo-4 AM（250μM）は優先的にSVZアストロサイト2をラベルの加圧。アストロ標識は特に我々が最近3を記載している血管の突起とendfeetの存在によって、ローダミン101、その形態と正の標識によって検証されています。これらのメソッドを使用して、我々はSVZの神経芽細胞とアストロサイト集団（ 図1）の両方で自発的活動を観察している。アストロサイトにおける活動は、多くの場合、血管3従事する波の形をとる。さらに、アッセイとしてカルシウムイメージングを用いて、薬理学的ア ゴニストのアプリケーションは、神経芽細胞およびアストロサイト6の受容体は、神経芽4日 、AMPAおよびNMDA受容体のGABAの発現を明らかにしたか、確認しています。
統計
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図1。アストロサイトのカルシウム活動を伝播（A）代表はカルシウム活性のタイムラプス撮影から画像を平均した。 SVZにおけるアストロサイトは、スライスの奥深くAMのFluo-4の加圧を負荷した。映画は、0.75秒の時間ステップで取得した。関心領域（ROI）の領域が活性を示す細胞の上に配置されています。 （B）はROIをからのトレースは、（A）に示されている映画のセルの上に配置。トレースは、移動平均と正規でろ過した。縦軸はFは信号強度とF 0である2×Δf/ fは0を表し、平均ベースライン信号とΔf= FF 0です。
図2：灌流システムの写真。チューブの一端は、95％O 2/5％CO 2ガス-pの中に沈められるerfusedソリューション。次いで、この溶液を蠕動ポンプ（図示せず）によりチューブを通って、入浴室に灌流される。もう一方の端は、プラットフォームに搭載され、浴室の溶液注入口に挿入されます。吸引チップは、チャンバの液出口に接続されており、解決策の高さを決定するためのレベルで設定されます。コンセントから、吸引先端がチャンバーから廃棄容器に溶液を吸引する真空ラインに接続されている。灌流システムは見やすくするため、顕微鏡のステージを披露しています。
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Discussion
SVZ細胞のカルシウムイメージングは、神経芽細胞10、両方の神経芽細胞およびアストロサイト4,6,8とアストロサイトのカルシウム波3受容体チャネル発現における自発活動のパターンを研究するために使用されています。 SVZにおける細胞はどちら未熟であるか、またはグリア特性を持っているので、彼らは成熟したネットワークでの活動を示す電位におけるミリ秒の変化は、この地域では適用されないことを意味し、活動電位11,12を起動しません。したがって、遅いカルシウムイベント（秒のオーダーで）キャプチャすると生物学的に意味がないだけですが、おそらく、これらの細胞における活動の最も関連性の高い形。
調べでは、特にスライスの健康に関しては、この手順には多くのステップを意識しなければなりません。ソリューションの不適切な作りは、悪い水質（ソリューションを作るために使用される）、遅い、不正確解剖し、組織を切断する汚いかみそりの刃を使用すると、すべての有害なefを及ぼす可能性があります活動上のfects。
我々は唯一のFluo-4AMの使用について議論しながら、カルシウム指示薬の使用に関しては、、我々は、Fluo-4をベースラインよりも高い負荷レベルを持つオレゴングリーンBAPTA-AMを含む他の市販の染料を、試してみました。他の染料と比較して、その大きなダイナミックレンジのために我々は、Fluo-4をに焦点を当てることを選んだが、他の研究者は、彼らの目的のために異なる色素が有利かもしれません。すべての染料は、特定の細胞タイプごとに異なる親和性を有することができる。ローディングの濃度及び方法は、それぞれの色素のために調整する必要があるかもしれません。我々は、優先的にSVZアストロサイトおよび健康で、より深い細胞を標識するために負荷圧力を使用していました。考慮すべき要因は、財政圧力ピペットで色素溶液が凍結して、翌日再利用することができますが、加圧を使用する場合は、お風呂のアプリケーションよりも高価であるということです。あるいは、このようなGCaMP3として遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬（GECIs）は、他のシステムとブラジャーを研究するためにますます人気があった地域13,14インチこれらGECIsは、細胞特異的プロモーターで駆動されるという利点がありますが、それらの動態およびダイナミック·レンジは、一般的に有機色素15よりも良いではありません。生後SVZにおけるそれらの使用はまた、構造物のウイルス標識またはエレクトロポレーションは、細胞分裂時にプラスミドの消失に起因する新生児期に神経芽細胞の研究を制限し、後者を必要とします。
スライスドリフトムービーの持続時間中に信頼性の高い信号捕捉を防ぎ、脳スライスのライブイメージング実験で最もチャレンジングな技術的なハードルの一つです。それは、灌流速度、真空の配置、客観重量、および、該当する場合は、温度勾配を含むいくつかの要因によって影響されます。 25℃を超える温度Cは実験のために必要な場合は、1は、温度が重要で、uにつながるかもしれないので、彼らは彼らの質問に対処することができる最低温度でのソリューションと灌流チャンバーを加熱するのを試みるべきndesired焦点ドリフト。客観ヒーターと温水のエンクロージャーはまた、我々は多くの成功なしで前者を試してみましたが、この影響を最小限に抑えることができます。
これらの技術的なハードルがなければ、研究者は、検定する機会生後現像領域内のセルの数が多い。これは、神経新生を調節するプロセスに新たな洞察をもたらす可能性が集団レベル、上の活動に対処するための機会を提供します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（DC007681、AB）、CTの幹細胞助成（AB）、パーディー財団（AB）、博士号を取得する前のルース·L·キルシュシュタイン国立研究サービス賞（NRSA）（SZY）、およびNSFの大学院研究からの補助金によって支えられてフェローシップ（BL）。我々は、原稿上の有益なコメントをBordey室のメンバーに感謝します。本材料は、部分的にコネチカット幹細胞研究助成金プログラムの下コネチカット州によってサポートされた仕事に基づいています。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもコネチカット州の公式見解を示すものではない、コネチカットやCTイノベーションの州の公衆衛生省は、株式会社。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
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References
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