Summary

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

Published: September 19, 2012
doi:

Summary

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Abstract

Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyinde iki nörojenik bölgelerinin biri. SVZ astrositik özellikleri (SVZ astrositler denir), nöroblast, orta ve progenitör hücreler ile nöral progenitör hücreler gibi yoğun dolu hücreleri içerir. SVZ doğumlu nöroblast teğet onlar internöron içine ayırt koku ampul, büyük bir mesafe göç. Adezyon molekülleri ve difüze sinyalleri aracılığıyla intraselüler sinyalizasyon kontrol nöron önemli roller oynamaktadır. Bu sinyallerin çoğu hücreleri içinde ve arasında bilgi aktaran hücreiçi kalsiyum etkinliği tetikleyebilir. Kalsiyum faaliyet dışı sinyallerin faaliyet böylece yansıtıcı ve SVZ hücreler arasındaki fonksiyonel hücrelerarası sinyallerini anlamak için optimal bir yoldur.

Kalsiyum aktivite olgun astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere diğer birçok bölge ve hücre tipleri, çalışılmıştır. Ancak, loa için geleneksel yöntemkalsiyum gösterge boyası (yani banyo yükleme) ile d hücreleri tüm SVZ hücre tipleri yükleme at verimli değildi. Gerçekten de, SVZ de hücresel yoğunluk doku içinde yayılma boya engellemektedir. Buna ek olarak, daha iyi sagital dilimleri hazırlamak özellikle SVZ hücreleri, rostral-kaudal eksen üzerinde neuroblast göç akış üç-boyutlu düzenlemeleri koruyacaktır.

Burada, SVZ, kalsiyum göstergesi boya ile SVZ hücrelerin yükleme ve zaman atlamalı filmleri ile kalsiyum faaliyet edinimi içeren sagital kesitler hazırlamak için yöntemler tarif. Biz kullanılan Fluo-4 doku içindeki basınç uygulamasını kullanarak SVZ astrositler yüklenmesi için boya AM. Kalsiyum etkinlik ayırt tek tek hücreler için kesin bir çözüm sağlayan bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak kaydedildi. Bizim yaklaşım erişkin hipokampal subgranular dilimi ve embriyonik nörojenik bölgeleri dahil olmak üzere diğer nörojenik bölgeleri için geçerlidir. Buna ek olarak, boyalar, diğer tip olabilirTarif edilen yöntem kullanılarak yapılabilir.

Protocol

1. Çözümler, Diseksiyon ve Vibratome hazırlanması Çözümler Doğru osmolarite ve pH (Tablo 1) de hazır olmalıdır. Suni serebrospinal sıvı (ACSF) ile karşılaştırıldığında, diseksiyon çözeltisi, sodyum ve kalsiyum daha düşük konsantrasyonlarda, ve magnezyum daha yüksek konsantrasyonları ile hazırlanır. Bu dilimleme sırasında eksitotoksisite etkilerini en aza indirmektir. Hem disseksiyon ve ACSF çözüm% 95 O2 /% 5 7.3, istenen pH değerinin e…

Discussion

SVZ hücrelerinin kalsiyum görüntüleme nöroblast 10, hem nöroblast ve astrositler 4,6,8 ve astrositik kalsiyum dalgalar 3 reseptör kanal ifadede spontan aktivitede desen çalışması için kullanılır olmuştur. SVZ hücreleri ya olgunlaşmamış veya glial özelliklere sahip olduklarından olgun ağlarındaki aktivite göstergesi gerilim potansiyeli milisaniyelik değişimler bu bölgede geçerli değildir, yani aksiyon potansiyelleri 11,12 kovmayın. Bu nedenle, yava…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH (DC007681, AB), CT Kök Hücre hibe (AB), Pardee vakıf (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülleri (NRSA) (SZY) ve NSF Lisansüstü Araştırma hibeleri ile desteklenen Bursu (BL). Biz el yazması üzerinde faydalı yorumları için Bordey laboratuar üyelerine teşekkür. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Devlet tarafından desteklenen çalışma dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut Devlet'in resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Incorporated.

Materials

Solute Company Catalog Number Dissection (mM)
Sucrose Sigma S0389 Dissection: 147 mM
ACSF: 0 mM
NaCl Sigma S9888 Dissection: 42 mM
ACSF: 126 mM
KCl Sigma P3911 Dissection: 2.5 mM
ACSF: 2.5 mM
MgCl2.6H2O Sigma M9272 Dissection: 4.33 mM
ACSF: 1 mM
NaH2PO4.H2O Sigma S8282 Dissection: 1.25 mM
ACSF: 1.25 mM
Glucose Sigma G8270 Dissection: 10 mM
ACSF: 10 mM
NaHCO3 Sigma S6014 Dissection: 26 mM
ACSF: 26 mM
CaCl2.2H2O Sigma C3306 Dissection: 1.33 mM
ACSF: 2 mM

Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.

      [header]
Name Company Catalogue Number Comments
Vibratome Leica VT 1000S  
Super Glue Surehold or 3M Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond  
Dissection tools Roboz or Ted Pella    
Fluo-4 AM calcium-sensitive dye Invitrogen F14201  
Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye Invitrogen O6807  
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Invitrogen P3000MP  
Upright confocal microscope Olympus FV300 or FV1000  
Water-immersion objectives Olympus LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90)  
Micromanipulators Sutter MPC-200/MPC-325/MPC-385  
Pressure controller Parker Hannifin Picospritzer <3 PSI during application
Pipette puller Sutter or Narshige Sutter P-97 or Narshige PP-830  
Glass pipettes Sutter BF150-110-10 I.D.:1.10, O.D.: 1.50
Peristaltic pump Harvard Apparatus Model 720 flow rate: 1 ml/min
Chamber bath Warner Instruments RC-26 GLP Low profile allows for objective clearance
Tubing Tygon    
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B/344B  

Table 2. Materials/equipment list.

References

  1. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
  2. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
  3. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
  4. Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  5. Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
  6. Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
  7. Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
  8. Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
  9. Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  10. Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
  11. Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
  12. Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
  13. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  14. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
  15. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).

Play Video

Cite This Article
Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J., Bordey, A. Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (67), e4071, doi:10.3791/4071 (2012).

View Video