Summary
En fremgangsmåde til at indlæse subventricular zone (SVZ) celler med calcium indikatorfarvestoffer til optagelse calcium aktivitet er beskrevet. Den postnatale SVZ indeholder tætpakkede celler, herunder neurale progenitorceller og neuroblaster. Snarere end at bruge bad loading vi injicerede farvestoffet ved tryk inde i vævet giver bedre farve diffusion.
Abstract
The subventricular zone (SVZ) er en af de to neurogene områder i den postnatale hjernen. The SVZ indeholder tætpakkede celler, herunder neurale progenitorceller med astrocytiske features (kaldet SVZ astrocytter), neuroblaster og mellemliggende progenitorceller. Neuroblaster født i SVZ tangentialt migrere en stor afstand til lugtekolben, hvor de differentierer til interneuroner. Intercellulære signalering gennem adhæsionsmolekyler og diffunderbare signaler spiller vigtige roller i kontrollerende neurogenese. Mange af disse signaler udløser intercellulær calcium aktivitet, der transmitterer information i og mellem celler. Calcium aktivitet er således afspejler aktiviteten af ekstracellulære signaler og er en optimal måde at forstå funktionel intercellulær signalering blandt SVZ celler.
Calcium-aktivitet er blevet undersøgt i mange andre regioner og celletyper, herunder modne astrocytter og neuroner. Men den traditionelle metode til load celler med calcium indikatorfarvestof (dvs. bad loading) var ikke effektiv ved pålæsning alle SVZ celletyper. Faktisk den cellulære tæthed i SVZ udelukker farvestoffet diffusion inde i vævet. Desuden vil fremstilling sagittale udsnit bedre bevarer den tredimensionelle arrangement af SVZ celler, især strømmen af neuroblast migration på den rostrale-caudale akse.
Her beskriver vi metoder til at forberede sagittale sektioner og indeholder SVZ, at lastningen af SVZ celler med calcium indikatorfarvestof, og købet af calcium aktivitet med time-lapse film. Vi anvendte Fluo-4:00 farvestof til lastning SVZ astrocytter hjælp trykpåføring inde i vævet. Calcium-aktivitet blev registreret ved hjælp af en konfokal mikroskop giver en præcis løsning for skelne de enkelte celler. Vores tilgang er anvendelig til andre neurogene zoner, herunder den voksne hippocampus subgranular zone og embryonale neurogene zoner. Endvidere kan andre typer af farvestofferpåføres ved anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde.
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger, dissektion og Vibratome
- Opløsninger skal fremstilles ved den korrekte osmolaritet og pH (tabel 1). Sammenlignet med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), der dissektion opløsning fremstillet med lavere koncentrationer af natrium og calcium, og højere koncentrationer af magnesium. Derved mindskes excitotoksicitet virkninger under udskæring.
- Både dissektion og ACSF løsninger skal være mættet med 95% O2 / 5% CO2 ved gennembobling i mindst 10 min for at nå den ønskede pH-værdi på 7,3.
- Forbered et isbad i en skuffe. Placere en dissektion plade i isbadet og fylde med dissektion opløsning. Bubble dissektion plade.
- Forbered vibratome ved at skabe et isbad. Placer sektionering skålen i isbadet, udfylde den skål med dissektion opløsning, og boblen.
- Fyld skive holdekammeret med ACSF og boble at sikre, at løsningen er tilstrækkeligt beluftes uansethvor skiver er placeret.
2. Fjernelse af hjernevæv
Akutte hjerneskiver tendens til at være sundere med yngre mus. Den postnatale SVZ cellulære arkitektur i gnavere er moden omkring postnatal dag (P) 20 1. Derfor forsøger vi at begrænse vores eksperimenter til mus alderen P20-P30, men vi har udført vellykkede forsøg på mus så gammel som 3 måneder. Gennem håndtering af vævet, skal man være opmærksomme på at minimere mekaniske bevægelser og pres til hjernen, vedligeholde afkølede forhold og udsættes SVZ til løsning så hurtigt som muligt, efter offer.
- Efter injektion af pentobarbital, er musen hurtigt halshugget. Pelsen fjernes, og indsnit foretages gennem bunden af kraniet. Hovedet placeres derefter i en bakke fyldt med dissektion opløsning.
- Mens stabilisere hovedet med pincet, der løbende nedskæringer lavet omkring kraniet og undertiden op midterlinjen med Microscissors. Vær omhyggelig med at minimere kontakt med vævet. Da lugtekolben er det endelige bestemmelsessted for nyfødte neuroner fra SVZ, skal man være opmærksom på at bevare dette område, især under fjernelse af knogle omkring dette område. Microscissor nedskæringer rundt om kraniet skal være på den dorsale side, for at tillade nem fjernelse af kraniet.
- Fjernelse af kraniet ligger over hjernen er nu adskilt fra knoglerne nedenunder hjernen. Hvis nedskæringer i det forrige trin er lavet korrekt, kan denne overliggende knogle fjernes nemt med en pincet eller tang.
- Mens stadig holder hovedet med pincet, kan man anvende en kirurgisk kniv til rent fjerne flere stykker af hjernevæv før skæring, såsom de følgende. En koronale snit kan foretages på niveauet for lambda. Sagittale snit kan foretages på begge sider af hjernen lateralt i forhold til SVZ. Et konservativt skøn ville være ~ 2,5 mm fra midterlinien. Om ønsket kan hjernen også hemisected her. Disse nedskæringer vil både facilitate montering af vævet og tillade SVZ skal nås hurtigere, når hjernen udskæring. Det er vigtigt at huske at lægge den minimale mængde af mekaniske kræfter på hjernen (f.eks ikke skubbe eller trække).
3. Akut Brain Slice Preparation
- Som forberedelse til efterfølgende trin, sikre, at den super lim, der anvendes til montering af vævet er fri for træsko og klar til at gælde for vibratome plade. Det er vigtigt at gå så hurtigt som muligt uden at beskadige hjernen.
- Hjernevævet kan derefter scorede nedefra, som adskiller væv fra underliggende knogle og samtidig separation af nerver.
- Vævet monteres og limet på en plade og placeres på vibratome. På grund af den rostral-caudale anatomi SVZ har vi fokuseret på at gøre sagittale skiver da det bevarer vandrende vej for neuroblaster, den glial skede, og karrene, der er stort set på linie i denne retning. Man kan enten moUNT vævet ved midterlinjen, eller på den flade overflade skabt ved at gøre sagittale snit laterale til SVZ. Et valgfrit trin er at placere en 3% agarose blok bag væv til at tjene som et anlæg til bladet som skiverne falde af. Vi fortrinsvis anvendes cyanoacrylat-baseret superlim.
- Skyl bladet med ethanol for at fjerne olier og skylles med destilleret vand. Placer bladet på klingeholderen. Monter klingeholderen til vibratome.
- Juster vibratome indstillinger for at skære væv med en tykkelse på 250-350 um pr skive. Det er vigtigt at skære ved hjælp af højfrekvente vibrationer og lav hastighed.
- Sektion gradvis gennem vævet. Udseendet af lugtekolben er en god indikator for, at man er i nærheden af SVZ i sagittale udsnit som de mest laterale skiver vil hverken indeholder regionen. Andre seværdigheder at se til, omfatter ventriklen og fortykkelse af corpus callosum, under hvilken SVZ er placeret. Den SVZ vises først i mere lateral sagitlæggende skiver. RMS vil vise i mediale sagittale skiver.
- Fjern skiver indeholdende SVZ med et plast Pasteur-pipette med spidsen skåret af. Overførsel til skive holdekammer. Vi ofte får flere skiver end vi kan bruge i en arbejdsdag. Imidlertid vil skiver variere afhængig af mængden af celler indeholdende SVZ. Det er undertiden nødvendigt at kigge gennem flere skiver for at finde en ønsket til billeddannelse.
4. Fremstilling af mikroskopet og Farvestoffer
Skiverne kræver en times inkubationstiden i ACSF at tilbagesøge den dissektion og udskæring. Flere trin kan udføres i løbet af denne skive opsving periode.
- Fremstilling af pipetter for calcium farvestof og / eller lægemiddelpåføring
- Glaspipetter skal have en spids på 2-3 um i diameter og en spids længde (~ 2 mm) og vinkel (~ 16 ° for pipetten indehaveren) der forhindrer kontakt med perfusionskammeret og giver plads til placering afmålet.
- Man kan typisk forberede 6-8 tryk pipetter for hver dag af eksperimenter.
- Calcium farvestof forberedelse
- Ved udarbejdelsen af brugsopløsning (4-5 uM efter bad, 250 pM ved tryk ansøgning), er det bedst at eksponere den minimale mængde af DMSO til celler. Dette kan opnås ved at stærkt koncentrerede bestande. For eksempel, for Fluo-4 er et rør indeholdende 50 ug anvendes pr. Man kan foretage en 10 mM stamopløsning af denne portion ved tilsætning af 4,6 pi Pluronic F-127 opløst i 20% DMSO.
- Fremstilling mikroskop setup (figur 2).
- Anvendelse af en peristaltisk pumpe til løsning flow har hjulpet minimere billede drift. Kør den peristaltiske pumpe før tillade ACSF at løbe igennem perfusion linjer og sikre, at det er boble-fri.
- Sæt rørindløbet på perfusionskammeret og sikre, at der ikke er utætheder.
- Placer vakuum tip til ensure at opløsningen bliver aspireret fra perfusionskammeret. Sørg for, at det er på et passende niveau, så målet er nedsænket i den rigtige arbejdsdag afstand, men ikke så højt, således at løsningen kan smitte af kammeret. Et lavt niveau af løsning vil også minimere flow fordrejninger. En konstant aspiration kan også kontrolleres ved at lytte efter stabilitet.
5. Dye Loading
Denne metode er beskrevet i detaljer i et andet manuskript 2. Se tallene deri.
- Bath loading dye
- Foretag en 1-2 ml arbejdsopløsning af farvestoffet. For Fluo-4 AM, er en koncentration på 4-5 uM tilstrækkelig til mærkning SVZ neuroblaster.
- Skiver først overført til en 35 mm dyrkningsskål med en maskestørrelse bunden, der allerede er fyldt med ACSF. Udskift løsning ved hjælp af en 3 ml plastik overførselspipetten til forsigtigt at fjerne ACSF, samtidig tilføje calcium farvestof arbejder løsning.
- Inkuber ved 37 ° C i 30-60 min i en 5% CO2 gas-kontrolleret miljø.
- Sæt skive tilbage i ACSF fyldt holdekammeret at vaske væk farvestof, som endnu ikke er trådt celler. Alternativt kan man placere den direkte på mikroskopet perfusionskammeret, der kører ACSF. Denne vask tidsrum er 30-45 minutter.
- Overfør skive til perfusionskammeret.
- Trykpåføring af farvestof
- Overfør udsnit fra holdekammeret til perfusionskammeret på mikroskopet setup.
- Fyld et glas pipette med en fungerende løsning, der er 250 uM og sted på mikromanipulator.
- Sænke pipetten til regionen af interesse. Pipetten kan placeres således, at spidsen er enten flere mikrometer over skiven overflade eller begravet flere mikrometer under skive overflade, men væk fra den indspillede region. Vinklen af pipetten ikke Affect lastning effektivitet. Når billeddannelse under skive overflade, finder vi, at placere pipettespidsen under afbildningsplanet vil mærke vores ønskede billedområde bedre.
- Når trykket anvender farvestoffet, indstilles Picospritzer så den er <3 psi. Vi har ikke estimeret mængden af farvestof diffusion, fordi det er underkastet variation af pipettespidsen diameter, det tryk, og densiteten af vævet, hvor farvestof indsprøjtes. Vi anvender blot indtil vi opnår vores ønskede belastning, som vurderet ved øjet. Minimere beskadigelse af skiven under påføringen, især når spidsen er anbragt neden under den skive overflade. Ansøg om 1-2 min. Undertiden gentagne ansøgninger er nødvendige afhængigt af mærkning som vurderet ved øjet. Til denne koncentration og anvendelse varighed, finder vi, at påføring af farvestof fortrinsvis mærker neuroblaster mens under overfladen ansøgning fortrinsvis mærker astrocytter. Dog vil> 3 min ansøgning på 500 pM også mærke neuroblasteruanset om spidsen er over eller under den skive overflade (JC Platel, upubliceret observation). Tillad vask og skive recovery for 30-45 min.
6. Konfokal afbildning af calciumaktivitet
- Find området af interesse først med et lavere strømforbrug mål såsom 4x eller 10x. Placer i midten af feltet, før du skifter til en højere magt mål. På dette tidspunkt, kan man vurdere generelle skive sundhed ved at bemærke udseendet af SVZ celler under differential interferens kontrast (DIC). Sunde celler fremkommer runde og buttet. Desuden vil raske celler udviser svag Fluo-4 loading som formodes at nogen belastning ved alle eller lyse fluorescens (en døende celle).
- Sænk vand-nedsænkning mål på området af interesse, som nu dye-loaded. Enten en 40x eller 60x mål har været tilstrækkelige til vores behov, selv om 40x giver et bredere synsfelt og giver mulighed for større pipette adgang. Når billeddannelse underoverflade, vi ofte gå mindst 15 um under skive overflade, hvor den 3-dimensionelle arkitektur og celle sundhed er bedre bevaret.
- Kontroller, at perfusion og vakuum arbejder tilfredsstillende.
- Opsætning mikroskopet, så time-lapse opløsning og rumlig opløsning er indstillet til ønskede hastigheder. Til konfokal mikroskopi, må disse faktorer afbalanceres som en stigning i tidsmæssig opløsning medfører sædvanligvis et tab af rumlig opløsning på grund af scanning af systemets karakter. For calcium aktivitet, har vi afbildet en ramme cirka hver anden med en 512x512 pixel opløsning. Hvis flere kanaler erhvervet separat er nødvendigt, vil dette også påvirke erhvervelsesprocent. Indstil varighed af film (2-10 min).
- Indled køre. Hvis der udføres farmakologiske undersøgelser, vask på antagonister eller ikke-desensibiliserende agonister i mindst 5-10 min, og derefter lave en anden film af 5-10 min. Agonister, som kan desensibilisering receptorer kan akut anvendelse, såsom ved anvendelse af en PREssure pipette styres af en mikromanipulator.
7. Calcium Analysis
Analyse følger standardprocedurer, som vi beskrevet i pervious publikationer 2-4. F 0 (dvs. baseline) og F er de gennemsnitlige fluorescensintensiteter målt gennem alle områder af interesse (ROI'er) og i hver ROI hhv. En ændring i fluorescens blev anset for at være en Ca2 + stigning, hvis det var> 15% F / F 0 stigning. Intracellulære Ca2 +-ændringer, blev beregnet under anvendelse Calsignal 5.
8. Repræsentative resultater
Vi har været i stand til at opnå selektiv indlæsning af SVZ celler afhængigt af farvning loading protokollerne der er beskrevet ovenfor og andre steder 2-4,6. Badekar lastning eller trykpåføring på skive overfladen af Fluo-04:00 (4-5 eller 250 pM, henholdsvis) etiketter meste neuroblaster. Mens trykpåføring kan indlæse neurobvarer hurtigere end bad belastning i en enkelt skive, bad belastning tillader samtidig belastning af flere udsnit. Vi bekræfter identiteten af mærkede celler som neuroblaster af (1) hvorvidt de viser vandrende adfærd 4,7, (2) deres morfologi, (3) negativ farvning af sulforhodamin 101, en astrocyt-specifikke farvestof 3 eller (4) positiv farvning med DCX-DsRed udtryk (JC Platel, upubliceret observation). Neuroblaster migrere hurtigt (gennemsnit på 60 um / time) ved fysiologisk temperatur 4,7-9, men deres bevægelse let kan observeres selv ved stuetemperatur. Bevægelsen af neuroblaster ikke udgør et problem med hensyn til at placere regioner-af-interesse (ROI) for at spore calcium aktivitet, da vores film er typisk kort varighed. Men under lange ventetider, såsom under lægemiddelopløsning udvekslinger skal efterforskerne være omhyggelig med at matche ROI'er i kontrol og behandling perioder. Det er ikke ualmindeligt for neuroblaster at migrere ind i eller ud af i maging felt eller brændplanet.
Pressure anvendelse af Fluo-4 AM (250 uM) dybt ind i skive og for begrænset varighed (<2 min) fortrinsvis mærker SVZ astrocytter 2. Astrocyt mærkning er blevet verificeret ved positiv mærkning med sulforhodamin 101 og deres morfologi, især ved tilstedeværelsen af projektioner og endfeet på blodkar, som vi for nylig har beskrevet 3. Under anvendelse af disse fremgangsmåder, har vi observeret spontan aktivitet i både SVZ neuroblast og astrocyt population (Figur 1). Aktiviteten i astrocytter tager ofte form af bølger, der engagerer blodkar 3. Under anvendelse af calcium billeddannelse som et assay, er anvendelsen af farmakologiske agonister afslørede eller bekræftede ekspression af GABAA-receptorer på neuroblaster og astrocytter 6, AMPA-og NMDA-receptorer på neuroblaster 4.
Tal
1 "src =" / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg "/>
Figur 1. Plantemateriale calcium aktivitet i astrocytter. (A) Repræsentant gennemsnit billede fra en time-lapse optagelse af calcium aktivitet. Astrocytter i SVZ blev fyldt med tryk anvendelsen af Fluo-04:00 dybt ind i skive. Film blev erhvervet på 0,75 s time-trin. Regioner af interesse (ROI) er placeret over celler, der udviser aktivitet. (B) Traces fra ROI'er placeret over celler fra filmen vist i (A). Spor blev filtreret med et glidende gennemsnit og normaliseret. Den vertikale skala betegner 2 x bf / F 0 hvor F er signalintensitet og F 0 er den gennemsnitlige basislinie signal og bf = FF 0.
Figur 2. Billede af perfusionssystemet. Ene ende af et rør er nedsænket i 95% O2 / 5% CO2 gas-perfused opløsning. Opløsningen derefter perfunderet gennem røret og til badkammeret af en peristaltisk pumpe (ikke vist). Den anden ende er indsat i opløsningen indløbet af badkammeret monteret på en platform. The aspiration tip forbindes derefter til opløsningen udløbet af kammeret, og på et niveau til bestemmelse opløsning højde. Fra udløbet er aspiration tip forbundet til vakuumledningen, som suger opløsningen fra kammeret ned i en affaldsbeholder. Perfusionssystemet er vist ud for mikroskopbordet for visuel klarhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium billeddannelse af SVZ-celler er blevet anvendt til at studere mønstrene på spontan aktivitet i neuroblaster 10, receptorkanalen ekspression i både neuroblaster og astrocytter 4,6,8 og astrocytiske calcium bølger 3. Da celler i SVZ er enten umodne eller har gliale egenskaber, de ikke fyre handling potentialer 11,12, hvilket betyder, at millisekund ændringer i spændingspotentiale vejledende aktivitet i modne netværk ikke finder anvendelse i denne region. Derfor opfange de langsommere calcium begivenheder (i størrelsesordenen sekunder) er ikke kun biologisk meningsfuld, men måske den mest relevante form for aktivitet i disse celler.
Efterforskere skal være opmærksomme på mange trin i denne procedure, især med hensyn til skive sundhed. Forkert fremstilling af løsninger, kunne dårlig vandkvalitet (bruges til at lave løsninger), langsom og upræcis dissektioner, og brugen af beskidte barberblade til at skære væv har alle skadelig efeffekter på aktivitet.
Med hensyn til anvendelsen af calcium indikatorer, mens vi kun diskuteret anvendelsen af Fluo-4:00, har vi forsøgt andre kommercielle farvestoffer, herunder Oregon Green BAPTA-AM, som har en højere baseline loading end Fluo-4. Vi valgte at fokusere på Fluo-4 på grund af sin større dynamikområde sammenlignet med andre farvestoffer, men andre forskere kan finde forskellige farvestoffer fordelagtig til deres formål. Hvert farvestof kan have forskellig affinitet for visse celletyper. Koncentration og fremgangsmåde til lastning kan være nødvendigt at justere for hvert farvestof. Vi fortrinsvis anvendte tryk lastning at mærke SVZ astrocytter og sundere, dybere celler. En økonomisk faktor til at overveje at bruge trykpåføring er dyrere end bath ansøgning, skønt farveopløsningen i trykket pipette kan fryses og genbruges den næste dag. Alternativt er genetisk kodede calcium-indikatorer (GECIs), såsom GCaMP3, været stadig mere populært for at studere andre systemer og bhi regionerne 13,14. Disse GECIs har den fordel drives under cellespecifikke promotorer, men deres kinetik og dynamisk område generelt ikke bedre end de organiske farvestoffer 15. Deres anvendelse i den postnatale SVZ kræver også viral mærkning eller elektroporering af konstruktionen, hvor sidstnævnte begrænser undersøgelse af neuroblaster i den neonatale periode på grund af tab af plasmid under celledeling.
Slice drift forhindrer pålidelig signal erhvervelse i løbet af filmen og er en af de mest udfordrende tekniske forhindringer med live-billeddannelse eksperimenter hjerneskiver. Det påvirkes af flere faktorer, herunder perfusionshastighed, vakuum placering, objektiv vægt, og, hvis det er relevant, temperaturgradienter. Hvis temperaturer over 25 ° C er nødvendige til forsøg, bør man forsøge at opvarme løsninger og perfusion kamre ved den laveste temperatur, hvor de kan opfylde deres spørgsmål, da temperaturer kan føre til betydelig, undesired fokus drift. Objektive varmeapparater og opvarmede indhegninger kunne også hjælpe med at minimere denne effekt, selv om vi har prøvet det tidligere uden den store succes.
Spærring disse tekniske forhindringer, har forskere mulighed for at analysere en lang række celler i en postnatal udvikling region. Dette giver mulighed for at behandle aktivitet på en befolkning, hvilket kunne give ny indsigt i de processer, der regulerer neurogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell tilskud (AB), Pardee fundament (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), og en NSF Graduate Research Fellowship (BL). Vi takker Bordey lab medlemmer for personer kommentarer til manuskriptet. Det foreliggende materiale er baseret på arbejde delvis støttet af staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Dens indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter i staten Connecticut, Institut for Folkesundhed i staten Connecticut eller CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
|||
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
