En fremgangsmåde til at indlæse subventricular zone (SVZ) celler med calcium indikatorfarvestoffer til optagelse calcium aktivitet er beskrevet. Den postnatale SVZ indeholder tætpakkede celler, herunder neurale progenitorceller og neuroblaster. Snarere end at bruge bad loading vi injicerede farvestoffet ved tryk inde i vævet giver bedre farve diffusion.
The subventricular zone (SVZ) er en af de to neurogene områder i den postnatale hjernen. The SVZ indeholder tætpakkede celler, herunder neurale progenitorceller med astrocytiske features (kaldet SVZ astrocytter), neuroblaster og mellemliggende progenitorceller. Neuroblaster født i SVZ tangentialt migrere en stor afstand til lugtekolben, hvor de differentierer til interneuroner. Intercellulære signalering gennem adhæsionsmolekyler og diffunderbare signaler spiller vigtige roller i kontrollerende neurogenese. Mange af disse signaler udløser intercellulær calcium aktivitet, der transmitterer information i og mellem celler. Calcium aktivitet er således afspejler aktiviteten af ekstracellulære signaler og er en optimal måde at forstå funktionel intercellulær signalering blandt SVZ celler.
Calcium-aktivitet er blevet undersøgt i mange andre regioner og celletyper, herunder modne astrocytter og neuroner. Men den traditionelle metode til load celler med calcium indikatorfarvestof (dvs. bad loading) var ikke effektiv ved pålæsning alle SVZ celletyper. Faktisk den cellulære tæthed i SVZ udelukker farvestoffet diffusion inde i vævet. Desuden vil fremstilling sagittale udsnit bedre bevarer den tredimensionelle arrangement af SVZ celler, især strømmen af neuroblast migration på den rostrale-caudale akse.
Her beskriver vi metoder til at forberede sagittale sektioner og indeholder SVZ, at lastningen af SVZ celler med calcium indikatorfarvestof, og købet af calcium aktivitet med time-lapse film. Vi anvendte Fluo-4:00 farvestof til lastning SVZ astrocytter hjælp trykpåføring inde i vævet. Calcium-aktivitet blev registreret ved hjælp af en konfokal mikroskop giver en præcis løsning for skelne de enkelte celler. Vores tilgang er anvendelig til andre neurogene zoner, herunder den voksne hippocampus subgranular zone og embryonale neurogene zoner. Endvidere kan andre typer af farvestofferpåføres ved anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde.
Calcium billeddannelse af SVZ-celler er blevet anvendt til at studere mønstrene på spontan aktivitet i neuroblaster 10, receptorkanalen ekspression i både neuroblaster og astrocytter 4,6,8 og astrocytiske calcium bølger 3. Da celler i SVZ er enten umodne eller har gliale egenskaber, de ikke fyre handling potentialer 11,12, hvilket betyder, at millisekund ændringer i spændingspotentiale vejledende aktivitet i modne netværk ikke finder anvendelse i denne region. Derfor op…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell tilskud (AB), Pardee fundament (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), og en NSF Graduate Research Fellowship (BL). Vi takker Bordey lab medlemmer for personer kommentarer til manuskriptet. Det foreliggende materiale er baseret på arbejde delvis støttet af staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Dens indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter i staten Connecticut, Institut for Folkesundhed i staten Connecticut eller CT Innovations, Incorporated.
Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
[header] | |||
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Vibratome | Leica | VT 1000S | |
Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
Tubing | Tygon | ||
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.