Summary
Subventricular क्षेत्र कोशिकाओं (SVZ) रिकॉर्डिंग कैल्शियम गतिविधि के लिए कैल्शियम सूचक रंगों के साथ लोड करने के लिए एक विधि का वर्णन है. प्रसवोत्तर SVZ तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं और neuroblasts कसकर बांध सहित सेल शामिल हैं. लोड हो रहा है स्नान का उपयोग करने के बजाय हम बेहतर डाई प्रसार की अनुमति के ऊतकों के अंदर दबाव से डाई इंजेक्शन.
Abstract
subventricular क्षेत्र (SVZ) प्रसव के बाद मस्तिष्क में दो तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों में से एक है. SVZ astrocytic (SVZ astrocytes कहा जाता है), neuroblasts, और मध्यवर्ती पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के साथ तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं सहित कोशिकाओं घनी पैक शामिल हैं. SVZ में पैदा हुआ Neuroblasts tangentially घ्राण बल्ब, जहां वे interneurons में अंतर करने के लिए एक महान दूरी विस्थापित. आसंजन अणु और प्रसारण संकेतों के माध्यम से कहनेवाला संकेतन को नियंत्रित करने neurogenesis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन संकेतों के कई कहनेवाला कैल्शियम गतिविधि है कि अंदर और कोशिकाओं के बीच में जानकारी पहुंचाता ट्रिगर. कैल्शियम गतिविधि कोशिकी संकेतों की गतिविधि के इस प्रकार से प्रतिबिंबित करता है और SVZ कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक कहनेवाला संकेत समझने के लिए एक इष्टतम तरीका है.
कैल्शियम गतिविधि कई अन्य क्षेत्रों और परिपक्व astrocytes और न्यूरॉन्स सहित सेल प्रकार में अध्ययन किया गया है. हालांकि, loa पारंपरिक विधिकैल्शियम सूचक डाई (यानी स्नान लोड हो रहा है) के साथ कोशिकाओं के सभी SVZ सेल प्रकार लोड करने में सक्षम नहीं था. दरअसल, SVZ में सेलुलर घनत्व ऊतक के अंदर डाई प्रसार precludes. इसके अलावा, बाण के समान स्लाइस की तैयारी बेहतर SVZ कोशिकाओं, विशेष रूप से व्याख्यान चबूतरे वाला - दुम का अक्ष पर neuroblast प्रवास के धारा के तीन आयामी व्यवस्था की रक्षा करेंगे.
यहाँ, हम बाण के समान वर्गों SVZ, कैल्शियम सूचक डाई साथ SVZ कोशिकाओं के लोड हो रहा है, और समय चूक फिल्मों के साथ कैल्शियम गतिविधि के अधिग्रहण युक्त तैयार करने की विधियों का वर्णन. हम प्रयोग किया जाता Fluo-4 SVZ ऊतक के अंदर दबाव आवेदन का उपयोग astrocytes लोड करने के लिए डाई AM. कैल्शियम गतिविधि एक स्कैनिंग confocal विशिष्ठ व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए एक सटीक संकल्प की अनुमति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज की गई थी. हमारा दृष्टिकोण वयस्क hippocampal subgranular क्षेत्र और भ्रूण तंत्रिकाजन्य क्षेत्र सहित अन्य तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों के लिए लागू है. इसके अलावा, रंगों के अन्य प्रकार के कर सकते हैंवर्णित विधि का उपयोग कर लागू होता है.
Protocol
1. समाधान, विच्छेदन, और Vibratome की तैयारी
- समाधान सही osmolarity और पीएच (1 टेबल) में तैयार किया जाना चाहिए. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) की तुलना में, विच्छेदन समाधान सोडियम और कैल्शियम की कम सांद्रता और मैग्नीशियम की उच्च सांद्रता के साथ तैयार है. यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान excitotoxicity प्रभाव को कम करने के लिए है.
- दोनों विच्छेदन और ACSF समाधान 95% 2 हे / 5% कम से कम 10 मिनट के लिए बुदबुदाती पीएच 7.3 के वांछित तक पहुँचने के द्वारा सीओ 2 के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए
- एक ट्रे में एक बर्फ स्नान तैयार. बर्फ स्नान में एक विच्छेदन प्लेट प्लेस और विच्छेदन समाधान के साथ भरें. विच्छेदन प्लेट बुलबुला.
- एक बर्फ स्नान बनाने के द्वारा vibratome तैयार. जगह बर्फ स्नान में सेक्शनिंग पकवान, विच्छेदन समाधान, और बुलबुले के साथ थाली भर.
- ACSF और बुलबुला साथ कक्ष पकड़ सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान टुकड़ा भरें पर्याप्त परवाह किए बिना वातित हैजहां स्लाइस रखा जाता.
2. मस्तिष्क के ऊतकों का हटाया जाना
तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें युवा चूहों के साथ स्वस्थ हो जाते हैं. प्रसवोत्तर SVZ कृन्तकों में सेलुलर वास्तुकला प्रसवोत्तर (पी) 1 20 दिन के आसपास परिपक्व है. इसलिए, हम-P20 P30 माउस उम्र के लिए हमारे प्रयोगों को सीमित करने की कोशिश है, लेकिन हम 3 महीने के रूप में पुराने के रूप में चूहों में सफल प्रयोगों प्रदर्शन किया है. ऊतक से निपटने के दौरान, एक यांत्रिक आंदोलनों और मस्तिष्क के लिए दबाव को कम करने के लिए, ठंडा की स्थिति बनाए रखने के लिए, और जितना जल्दी संभव हो निम्न बलिदान समाधान के लिए SVZ बेनकाब प्रति जागरूक होना चाहिए.
- Pentobarbital के इंजेक्शन के बाद, माउस तेजी से decapitated है. फर हटा दिया है और चीरों खोपड़ी के आधार के माध्यम से किया जाता है. सिर तो एक विच्छेदन समाधान के साथ भरा ट्रे में रखा गया है.
- जबकि संदंश के साथ सिर स्थिर, निरंतर कटौती खोपड़ी के आसपास बना रहे हैं और कभी कभी microsc साथ midline ऊपरissors. ऊतक के साथ संपर्क कम से कम करने के लिए सावधान रहो. घ्राण बल्ब SVZ से नवजात न्यूरॉन्स की अंतिम गंतव्य है, एक है कि इस क्षेत्र के संरक्षण के प्रति जागरूक हड्डी हटाने के दौरान विशेष रूप से इस क्षेत्र के आसपास होना चाहिए. Microscissor खोपड़ी के आसपास बना कटौती पृष्ठीय पक्ष पर हो सकता है, खोपड़ी के आसान हटाने के लिए अनुमति चाहिए.
- मस्तिष्क overlying खोपड़ी हटाने अब मस्तिष्क के नीचे हड्डियों से अलग है. यदि पिछले चरण में कटौती सही ढंग से बना रहे हैं, इस overlying हड्डी चिमटी या संदंश के साथ आसानी से हटाया जा सकता है.
- जबकि अभी भी संदंश के साथ सिर पकड़, एक एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करने के लिए सफाई से मस्तिष्क के ऊतकों के कई टुकड़े करने से पहले हटाने के लिए निम्नलिखित के रूप में टुकड़ा करने की क्रिया है, कर सकते हैं. एक राज्याभिषेक कटौती लैम्ब्डा के स्तर पर किया जा सकता है. बाण कटौती SVZ पार्श्व मस्तिष्क के दोनों पक्षों पर बनाया जा सकता है. एक रूढ़िवादी अनुमान ~ midline से 2.5 मिमी होगा. अगर वांछित, मस्तिष्क भी यहाँ hemisected किया जा सकता है. ये कटौती दोनों facil जाएगाऊतक के बढ़ते itate और SVZ अधिक जल्दी पहुँचा जा सकता है जब मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया की अनुमति. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए मस्तिष्क (उदाहरण के धकेलने के खींच या नहीं) पर यांत्रिक बलों की कम से कम मात्रा में लागू करने के लिए याद है.
3. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
- बाद के चरणों के लिए तैयार है, यह सुनिश्चित करना है कि सुपर गोंद ऊतक माउंट किया मोज़री से मुक्त है और vibratome प्लेट लागू करने के लिए तैयार है. यह महत्वपूर्ण है कि जितनी तेजी से मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना जाना.
- मस्तिष्क के ऊतकों तो नीचे है, जो अंतर्निहित हड्डी से ऊतक अलग जबकि साथ ही नसों को अलग से जीते जा सकते हैं.
- ऊतक घुड़सवार और एक थाली पर चिपके और vibratome पर रखा. SVZ शरीर रचना विज्ञान व्याख्यान चबूतरे वाला दुम का कारण, हम बाण के समान स्लाइस बनाने के रूप में यह neuroblasts के प्रवासी मार्ग, glial म्यान, और है कि इस दिशा में काफी हद तक जुड़ रहे हैं vasculature को बरकरार रखता है पर ध्यान केंद्रित किया है. एक या तो मो कर सकते हैंपर midline ऊतक या फ्लैट बाण के समान SVZ को पार्श्व में कटौती करने के द्वारा बनाई गई सतह पर UNT. एक वैकल्पिक कदम ऊतक के पीछे एक 3% agarose ब्लॉक जगह ब्लेड एक प्रतिस्पर्श के रूप में सेवा के रूप में स्लाइस से आते हैं. हम preferentially cyanoacrylate आधारित सुपर गोंद का इस्तेमाल किया.
- इथेनॉल के साथ ब्लेड तेलों को दूर करने के लिए और आसुत पानी से कुल्ला कुल्ला. ब्लेड धारक पर ब्लेड रखें. Vibratome ब्लेड धारक माउंट.
- टुकड़ा प्रति 250-350 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई में ऊतक में कटौती के लिए vibratome सेटिंग्स समायोजित करने के लिए. यह महत्वपूर्ण है कि उच्च आवृत्ति कंपन और कम गति का उपयोग कर काट.
- उत्तरोत्तर ऊतक के माध्यम से धारा. घ्राण बल्ब की उपस्थिति में एक अच्छा संकेत है कि एक बाण के समान स्लाइस के रूप में सबसे अधिक पार्श्व स्लाइस न तो क्षेत्र में शामिल होंगे में SVZ निकट है. अन्य स्थलों को देखने के लिए निलय और महासंयोजिका जो नीचे SVZ स्थित है का उमड़ना शामिल हैं. SVZ अधिक पार्श्व sagit में पहली बार दिखाई देगाताल स्लाइस. आरएमएस औसत दर्जे का बाण के समान स्लाइस में दिखाई देगा.
- एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ SVZ युक्त टिप काट स्लाइस निकालें. टुकड़ा होल्डिंग चैम्बर के लिए स्थानांतरित. हम अक्सर अधिक स्लाइस की तुलना में हम एक काम के दिन का उपयोग कर सकते हैं प्राप्त करते हैं. हालांकि, स्लाइस SVZ युक्त कोशिकाओं की राशि पर अलग अलग होंगे. यह कभी कभी आवश्यक कई स्लाइस के माध्यम से देखने के लिए एक इमेजिंग के लिए वांछित है.
4. माइक्रोस्कोप और रंगों की तैयारी
स्लाइस एक एक घंटे ACSF में ऊष्मायन समय विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया से उबरने की आवश्यकता है. कई कदम इस टुकड़ा वसूली की अवधि के दौरान किया जा सकता है.
- Pipettes कैल्शियम डाई और / या दवा आवेदन के लिए तैयार
- ग्लास pipettes व्यास और एक टिप (~ 2 मिमी) लंबाई और कोण (~ 16 विंदुक धारक °) कि छिड़काव कक्ष के साथ संपर्क रोकता में 2-3 सुक्ष्ममापी की एक टिप है की जरूरत है और के प्लेसमेंट के लिए कमरे की अनुमति देता हैउद्देश्य.
- एक प्रयोगों के प्रत्येक दिन के लिए आम तौर पर 6-8 दबाव pipettes तैयार कर सकते हैं.
- कैल्शियम डाई तैयारी
- जब काम समाधान (स्नान द्वारा 4-5 सुक्ष्ममापी, 250 सुक्ष्ममापी दबाव आवेदन के द्वारा) की तैयारी कर रहे हैं, यह सबसे अच्छा है कोशिकाओं को DMSO की न्यूनतम राशि का पर्दाफाश करने के लिए. यह अत्यधिक ध्यान केंद्रित शेयरों करके प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Fluo-4 के लिए, प्रति दिन एक 50 ग्राम युक्त ट्यूब प्रयोग किया जाता है. एक 4.6 Pluronic DMSO में F-127% 20 समाधान के μl जोड़कर इस अशेष भाजक के एक 10 मिमी शेयर कर सकते हैं.
- माइक्रोस्कोप सेटअप (2 चित्रा) की तैयारी.
- समाधान के प्रवाह के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करने के लिए मदद की है छवि बहाव को कम. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप चलाने के लिए पहले ACSF छिड़काव लाइनों के माध्यम से चलाने के लिए और यह सुनिश्चित करना है कि यह बुलबुला मुक्त है की अनुमति.
- छिड़काव चैम्बर पर ट्यूब इनलेट सेट करें और सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई लीक कर रहे हैं.
- सत्ता के लिए वैक्यूम टिप स्थितिure कि समाधान छिड़काव चैम्बर से aspirated किया जा रहा है. सुनिश्चित करें कि यह एक पर्याप्त स्तर पर इतना है कि उद्देश्य उचित काम दूरी पर डूब जाता है, लेकिन नहीं तो उच्च कि ऐसे समाधान कक्ष पर फैल सकता है. समाधान के एक निम्न स्तर भी प्रवाह विकृति को कम कर देंगे. एक निरंतर आकांक्षा भी स्थिरता के लिए सुन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है.
5. डाई लोड हो रहा है
इस पद्धति का एक और 2 पांडुलिपि में विस्तार में वर्णित किया गया है. आंकड़े उसमें देखें.
- स्नान loading डाई
- डाई 1-2 मिलीलीटर काम समाधान. AM Fluo-4, 4-5 सुक्ष्ममापी की एक एकाग्रता SVZ neuroblasts लेबलिंग के लिए पर्याप्त है.
- स्लाइस 1 एक जाल नीचे के साथ एक 35 मिमी संस्कृति डिश है कि पहले से ही ACSF से भर जाता है के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. एक 3 मिलीग्राम प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए धीरे ACSF हटाने समाधान बदलें, जबकि एक साथ ग जोड़नेalcium डाई समाधान काम कर रहा है.
- एक 5% सीओ 2 गैस नियंत्रित वातावरण में 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- टुकड़ा वापस ACSF से भरे कक्ष में दूर डाई कि कोशिकाओं में प्रवेश किया है धोने रखें. वैकल्पिक रूप से, एक यह सीधे खुर्दबीन छिड़काव चैम्बर कि ACSF चल रहा है पर जगह कर सकते हैं. इस धोने अवधि 30-45 मिनट है.
- छिड़काव चैम्बर के लिए टुकड़ा स्थानांतरण.
- डाई के दबाव आवेदन
- होल्डिंग चैम्बर से खुर्दबीन स्थापना पर छिड़काव कक्ष टुकड़ा स्थानांतरण.
- एक काम समाधान है कि 250 और micromanipulator पर सुक्ष्ममापी जगह है के साथ एक गिलास विंदुक भरें.
- विंदुक हित के क्षेत्र के लिए कम. विंदुक में रखा जा सकता है कि या तो टिप है टुकड़ा सतह से ऊपर या दफनाया टुकड़ा सतह के नीचे कई micrometers कई micrometers, लेकिन दर्ज क्षेत्र से दूर है. विंदुक के कोण नहीं affe थालोड हो रहा है दक्षता सीटी. जब टुकड़ा सतह के नीचे इमेजिंग, हम पाते हैं कि इमेजिंग विमान नीचे विंदुक टिप रखने हमारे वांछित इमेजिंग क्षेत्र बेहतर लेबल होगा.
- जब दबाव डाई आवेदन, Picospritzer इतना तय है कि यह <3 साई है. हम डाई प्रसार की मात्रा नहीं अनुमान है, क्योंकि इस विंदुक टिप व्यास की परिवर्तनशीलता के अधीन है, दबाव लागू है, और ऊतक के घनत्व जहां डाई इंजेक्ट किया जाता है. हम बस लागू है जब तक हम अपने वांछित loading को प्राप्त करने के रूप में आंखों से मूल्यांकन. टुकड़ा करने के लिए आवेदन के दौरान नुकसान को कम करने के लिए, खासकर जब टिप टुकड़ा सतह के नीचे रखा है. 1-2 मिनट के लिए लागू करें. कभी कभी दोहराया आवेदन आवश्यक लेबलिंग के रूप में आंख द्वारा मूल्यांकन के आधार पर कर रहे हैं. इस एकाग्रता और आवेदन की अवधि के लिए, हम पाते हैं कि डाई की सतह आवेदन preferentially neuroblasts लेबल जबकि सतह आवेदन नीचे preferentially astrocytes लेबल. हालांकि, 3 मिनट 500 सुक्ष्ममापी पर आवेदन भी neuroblasts लेबल होगाचाहे कि क्या टिप ऊपर या नीचे टुकड़ा सतह (जे.सी. Platel, अप्रकाशित अवलोकन) है. और 30-45 मिनट के लिए टुकड़ा वसूली धोने के लिए अनुमति दें.
6. कैल्शियम गतिविधि के Confocal इमेजिंग
- ब्याज के क्षेत्र के 4x या 10x रूप में एक उद्देश्य कम शक्ति के साथ 1 का पता लगाएं. एक उच्च शक्ति के उद्देश्य के लिए स्विच करने से पहले क्षेत्र के केंद्र में रखें. इस बिंदु पर, एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के तहत SVZ कोशिकाओं की उपस्थिति टिप्पण द्वारा सामान्य टुकड़ा स्वास्थ्य का आकलन कर सकते हैं. स्वस्थ कोशिकाओं दौर और मोटा दिखाई देते हैं. इसके अलावा, स्वस्थ कोशिकाओं बेहोश Fluo 4 लोड हो रहा है प्रदर्शन के रूप में सभी या प्रतिदीप्ति उज्ज्वल (एक मर सेल) में लोड करने के लिए नहीं माना जाता.
- ब्याज के क्षेत्र पर कम पानी विसर्जन उद्देश्य है, जो अब डाई लोड. या तो एक 40x या 60x उद्देश्य हमारी जरूरतों के लिए पर्याप्त है, हालांकि 40x देखने का एक व्यापक क्षेत्र प्रदान करता है और अधिक से अधिक उपयोग करने के लिए विंदुक अनुमति देता है. जब नीचे इमेजिंगसतह, हम अक्सर जहां वास्तुकला तीन आयामी और सेल स्वास्थ्य बेहतर संरक्षित कर रहे हैं टुकड़ा सतह के नीचे कम से कम 15 सुक्ष्ममापी जाना.
- सत्यापित करें कि छिड़काव और वैक्यूम पर्याप्त रूप से काम कर रहे हैं.
- माइक्रोस्कोप सेटअप इतना है कि समय व्यतीत हो जाने के संकल्प और स्थानिक संकल्प वांछित दरों के लिए सेट कर रहे हैं. Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए, इन कारकों अस्थायी समाधान में वृद्धि के रूप में संतुलित किया जाना चाहिए आमतौर पर स्थानिक संकल्प की एक हानि प्रणाली की स्कैनिंग प्रकृति के कारण में परिणाम है. कैल्शियम की गतिविधि के लिए, हम एक 512x512 पिक्सेल संकल्प के साथ लगभग हर दूसरे फ्रेम imaged है. यदि अलग का अधिग्रहण किया कई चैनलों के लिए आवश्यक हैं, यह भी अधिग्रहण की दर को प्रभावित करेगा. फिल्म की अवधि (2-10 मिनट) सेट.
- चलाने के आरंभ करें. यदि औषधीय अध्ययनों प्रदर्शन, कम से कम 5-10 मिनट के लिए गरम या गैर desensitizing agonists पर धो लें, और फिर 5-10 मिनट की एक और फिल्म बनाने. Agonists कि रिसेप्टर्स असंवेदनशील हो सकता है इस तरह के रूप में तीव्रता से किया जा सकता है, एक जनसंपर्क का उपयोग करके लागूविंदुक essure एक micromanipulator द्वारा नियंत्रित है.
7. कैल्शियम विश्लेषण
विश्लेषण मानक प्रक्रिया है कि हम प्रवेशनीय प्रकाशनों में 2-4 वर्णित निम्नानुसार है. एफ (यानी आधारभूत) 0 और एफ मतलब प्रतिदीप्ति ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों के सभी भर में और प्रत्येक ROI में मापा तीव्रता, क्रमशः हैं. प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन Ca 2 + वृद्धि हो सकता है अगर यह> 15 / एफ 0% वृद्धि हुई थी माना जाता था. Intracellular Ca 2 + परिवर्तन 5 Calsignal का उपयोग कर की गणना की गई.
8. प्रतिनिधि परिणाम
हम SVZ डाई लोड हो रहा है ऊपर और कहीं 2-4,6 वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर कोशिकाओं के चयनात्मक लोड प्राप्त करने में सक्षम हो गया है. स्नान या Fluo 4-AM (4-5 या 250 सुक्ष्ममापी, क्रमशः) ज्यादातर लेबल neuroblasts का टुकड़ा सतह पर दबाव आवेदन लोड हो रहा है. जबकि दबाव आवेदन neurob लोड कर सकते हैंएक टुकड़ा में स्नान लोड से अधिक तेजी से रहता है, स्नान लोड हो रहा है कई स्लाइसें के साथ लोडिंग की अनुमति देता है. हम (1) द्वारा neuroblasts के रूप में लेबल की कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करते हैं कि वे प्रवासी व्यवहार 4,7, (2) अपने आकारिकी, (3) 101 sulforhodamine की नकारात्मक धुंधला हो जाना, एक astrocyte विशिष्ट डाई 3 या (4) सकारात्मक धुंधला के साथ प्रदर्शित DCX DsRed अभिव्यक्ति (जे.सी. Platel, अप्रकाशित अवलोकन). Neuroblasts ओर पलायन (60 सुक्ष्ममापी / घंटा की औसत) जल्दी शारीरिक 4,7-9 तापमान पर है, लेकिन उनके आंदोलन को आसानी से कमरे के तापमान पर भी मनाया जा सकता है. neuroblasts के आंदोलन क्षेत्रों के हित कैल्शियम (आरओआई) गतिविधि पर नज़र रखने के बाद से हमारी फिल्मों को आम तौर पर कर रहे हैं अवधि में कम रखने के लिए संबंध के साथ एक समस्या उत्पन्न नहीं करता है. हालांकि, इस तरह के रूप में लंबे समय से प्रतीक्षा, दवा समाधान आदान - प्रदान के दौरान की अवधि के दौरान, जांचकर्ताओं नियंत्रण और उपचार अवधि में ROIs मैच सावधान होना चाहिए. यह असामान्य neuroblasts में या मैं के बाहर विस्थापित करने के लिए नहीं है maging क्षेत्र या फोकल हवाई जहाज़.
Fluo चार AM (250 सुक्ष्ममापी) गहरे टुकड़ा में दबाव और सीमित अवधि (<2 मिनट) के लिए आवेदन preferentially SVZ astrocytes लेबल 2. Astrocyte लेबलिंग sulforhodamine 101 और उनके morphology के साथ सकारात्मक लेबलिंग द्वारा सत्यापित किया गया अनुमानों और रक्त वाहिकाओं पर endfeet है जो हम हाल ही में 3 का वर्णन किया है की उपस्थिति के द्वारा विशेष रूप से,. इन तरीकों का उपयोग कर, हम दोनों SVZ neuroblast और astrocyte जनसंख्या (1 चित्रा) में सहज गतिविधि मनाया गया है. astrocytes में गतिविधि अक्सर तरंगों है कि रक्त वाहिका 3 संलग्न के रूप लेता है. इसके अलावा, एक परख के रूप में कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग, औषधीय agonists के आवेदन से पता चला है या GABA की अभिव्यक्ति neuroblasts और 6 astrocytes पर रिसेप्टर्स, 4 neuroblasts पर AMPA और NMDA रिसेप्टर्स की पुष्टि की.
आंकड़े
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चित्रा 1. Astrocytes में कैल्शियम गतिविधि प्रचार (ए) प्रतिनिधि कैल्शियम गतिविधि के एक समय चूक रिकॉर्डिंग से छवि औसत. SVZ में astrocytes Fluo-4 के दबाव के आवेदन के साथ लोड किया गया टुकड़ा में गहरी हूँ. सिनेमा 0.75 समय कदम में हासिल किया गया. ब्याज की क्षेत्र (आरओआई) गतिविधि प्रदर्शन कोशिकाओं पर रखा जाता है. (बी) ROIs से निशान (ए) में चित्रित फिल्म से कोशिकाओं पर रखा. निशान एक चलती औसत और normalized साथ फ़िल्टर्ड किया गया. ऊर्ध्वाधर पैमाने 2 का प्रतिनिधित्व करता है x / ΔF 0 एफ जहां एफ संकेत तीव्रता और एफ 0 औसत आधारभूत संकेत और ΔF = 0 एफएफ है.
चित्रा 2 छिड़काव प्रणाली के चित्र एक ट्यूब के एक छोर से 95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस पी में डूबे हुए हैerfused समाधान. समाधान तो एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप () नहीं दिखाया ट्यूब के माध्यम से और स्नान कक्ष perfused. दूसरे छोर स्नान एक मंच पर घुड़सवार चैम्बर के समाधान इनलेट में डाला जाता है. आकांक्षा टिप तो चैम्बर के समाधान के आउटलेट से जुड़ा है और समाधान ऊंचाई निर्धारित करने के लिए एक स्तर पर निर्धारित किया है. आउटलेट से, आकांक्षा टिप निर्वात लाइन है, जो एक कचरे के कंटेनर में चैम्बर से समाधान रेस्पायरेट्रस से जुड़ा है. छिड़काव प्रणाली से दृश्य की स्पष्टता के लिए मंच खुर्दबीन दिखाया गया है.
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Discussion
SVZ कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग 10 neuroblasts, रिसेप्टर दोनों neuroblasts और astrocytes 4,6,8 और astrocytic कैल्शियम 3 लहरों में चैनल की अभिव्यक्ति में सहज गतिविधि में पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. चूंकि SVZ में कोशिकाओं या तो अपरिपक्व हैं या glial गुण है, वे कार्रवाई 11,12 क्षमता आग नहीं करते हैं, जिसका अर्थ है कि वोल्टेज क्षमता में millisecond परिवर्तन परिपक्व नेटवर्क में गतिविधि का संकेत इस क्षेत्र में लागू नहीं है. इसलिए, धीमी कैल्शियम घटनाओं (सेकंड के आदेश पर) पर कब्जा न केवल biologically सार्थक है, लेकिन शायद इन कोशिकाओं में गतिविधि के सबसे अधिक प्रासंगिक रूप.
जांचकर्ता टुकड़ा स्वास्थ्य के संबंध के साथ विशेष रूप से, इस प्रक्रिया में कई कदम के प्रति जागरूक होना चाहिए. समाधान के अनुचित लेने, गरीब पानी गुणवत्ता (समाधान को बनाने के लिए इस्तेमाल), धीमी और imprecise dissections, और गंदा रेज़र ब्लेड का उपयोग करने के लिए ऊतक में कटौती सभी हानिकारक एफई हो सकता हैगतिविधि पर fects.
कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करने के लिए संबंध है, जबकि हम केवल Fluo - 04:00 के उपयोग पर चर्चा की, हम ओरेगन ग्रीन BAPTA रहा हूँ, जो Fluo-4 की तुलना में एक उच्च आधारभूत लोडिंग स्तर है सहित अन्य वाणिज्यिक रंजक, करने की कोशिश की है. हम Fluo-4 पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना अपने बड़े गतिशील रेंज की वजह से अन्य रंगों की तुलना में, लेकिन अन्य जांचकर्ताओं के विभिन्न रंगों को अपने उद्देश्यों के लिए लाभप्रद मिल सकता है. हर डाई कुछ सेल प्रकार के लिए अलग संबंध हो सकता है. एकाग्रता और लदान विधि प्रत्येक डाई के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. हम preferentially दबाव SVZ astrocytes और स्वस्थ, गहरी कोशिकाओं लेबल लोड हो रहा है. एक वित्तीय पहलू पर विचार करना है कि दबाव अनुप्रयोग का उपयोग कर अधिक स्नान आवेदन की तुलना में महंगा है, हालांकि दबाव विंदुक में डाई समाधान जमे हुए किया जा सकता है और अगले दिन reused. वैकल्पिक रूप से, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम (GECIS) के ऐसे GCaMP3 रूप में, संकेतक, तेजी से लोकप्रिय अन्य प्रणालियों और ब्रा के अध्ययन के लिए किया गया है13,14 क्षेत्रों में. इन GECIS सेल विशिष्ट प्रमोटरों के तहत संचालित किया जा रहा लाभ है, लेकिन आम तौर पर उनके कैनेटीक्स और गतिशील रेंज कार्बनिक 15 रंगों की तुलना में बेहतर नहीं हैं. प्रसवोत्तर SVZ में उनका उपयोग भी वायरल लेबलिंग या निर्माण के electroporation, neuroblasts के अध्ययन सीमित प्लाज्मिड के कोशिका विभाजन के दौरान नुकसान के कारण नवजात की अवधि के लिए बाद की आवश्यकता है.
स्लाइस बहाव फिल्म की अवधि के दौरान विश्वसनीय संकेत अधिग्रहण रोकता है और एक मस्तिष्क स्लाइसें के रहते इमेजिंग प्रयोगों के साथ सबसे चुनौतीपूर्ण तकनीकी बाधाओं में से एक है. यह छिड़काव दर, वैक्यूम प्लेसमेंट, उद्देश्य वजन, और यदि लागू हो, तापमान gradients सहित कई कारकों से प्रभावित होता है. यदि 25 से अधिक तापमान ° C आवश्यक प्रयोगों के लिए, एक के लिए सबसे कम तापमान पर समाधान और छिड़काव कक्षों गर्मी का प्रयास जहां वे उनके सवालों को संबोधित करने के बाद से तापमान महत्वपूर्ण नेतृत्व कर सकते हैं कर सकते हैं करना चाहिए, यूndesired ध्यान केंद्रित बहाव. उद्देश्य heaters और गरम बाड़ों को भी मदद कर सकता है इस प्रभाव को कम हालांकि हम ज्यादा सफलता के बिना पूर्व की कोशिश की है.
इन तकनीकी बाधाओं को छोड़ दें, शोधकर्ताओं ने कोशिकाओं के एक प्रसव के बाद विकास के क्षेत्र में एक बड़ी संख्या परख करने का अवसर है. यह एक जनसंख्या के स्तर पर गतिविधि का पता करने के लिए, है जो neurogenesis को विनियमित करने की प्रक्रिया में नए अंतर्दृष्टि उपज सकता का अवसर प्रस्तुत करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH (DC007681, एबी), सीटी स्टेम सेल अनुदान (एबी), Pardee नींव (एबी), predoctoral रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा (एनआरएसए) पुरस्कार (SZY), और एक NSF स्नातकोत्तर अनुसंधान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया फैलोशिप (बीएल). हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए Bordey प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. वर्तमान सामग्री आंशिक रूप से कनेक्टिकट स्टेम सेल अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम के तहत कनेक्टिकट के राज्य द्वारा समर्थित काम पर आधारित है. इसकी सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और कनेक्टिकट के राज्य के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व, कनेक्टिकट या सीटी नवाचार राज्य के सार्वजनिक स्वास्थ्य के विभाग, शामिल है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
Table 2. Materials/equipment list. |
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References
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