Summary
Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.
Abstract
Homeostase da glucose é principalmente controlada pela insulina hormonas endócrinas e glucagon, secretada a partir da beta pancreáticas e células alfa, respectivamente. Massa celular funcional beta é determinado pela massa anatómica beta celular, bem como a capacidade das células beta para responder a uma carga de nutriente. Uma perda de massa funcional das células beta é central para ambas as formas principais de diabetes 1-3. Considerando que as declínio da capacidade funcional das células beta resultados de massa de um ataque auto-imune em pacientes com diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, este decréscimo se desenvolve tanto uma incapacidade das células beta a secretar insulina de forma apropriada e destruição das células beta de um quadro de mecanismos. Assim, os esforços para restabelecer a massa de células beta funcional são fundamentais para o melhor tratamento e possíveis curas para o diabetes.
Esforços estão em andamento para identificar caminhos moleculares que podem ser exploradas para estimular a replicação e melhorar a função das células beta.Idealmente, alvos terapêuticos iria melhorar tanto o crescimento das células beta e função. Talvez o mais importante é que para identificar se uma estratégia que estimula o crescimento das células beta está no custo da função das células beta prejudicando (tal como com alguns oncogenes) e vice-versa.
Sistematicamente suprimindo ou superexpressão de expressão de genes-alvo em ilhéus isolados de ratos, é possível identificar potenciais alvos terapêuticos para o aumento da massa funcional das células beta 4-6. Vectores adenovirais podem ser empregues para proteínas eficientemente superexpressam ou knockdown em ilhéus isolados de ratos 4,7-15. Aqui, nós apresentamos um método para manipular a expressão do gene utilizando transdução adenoviral e avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos (Figura 1). Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar novos alvos que modulam a replicação das células beta ou função 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Transdução adenoviral e cultura de ilhotas de ratos
- Prepara-se uma placa de 6 poços de cultura de tecido não-revestido por adição de 2 ml de meio (RPMI 1640 contendo 8 mM de glucose, 10% de soro fetal bovino, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina) para o número necessário de poços. Por exemplo, uma experiência típica pode exigir três poços - um para cada um controlo não-vírus, um controle de vírus (por exemplo, GFP-expressando adenovírus), eo grupo experimental.
- Aqueceu-se a placa a 37 ° C, colocando-a em uma cultura de tecidos incubadora durante pelo menos 30 min.
- Imediatamente após o isolamento de rato ilhota 18,19, o local de 100-200 ilhotas em poços individuais da placa de cultura de 6 poços tecido não-revestido. Sessenta ilhotas são necessários para a secreção de insulina e ensaios de incorporação de timidina. As ilhotas restantes podem ser utilizados para o isolamento de RNA para estudos de expressão génica ou isolamento de proteínas para immunoblotting.
[Nota: A partir deste ponto em diante, siga protocolos institucionais para o manejo, uso e descarte de materiais perigosos.]
- Agite ligeiramente a placa para trazer as ilhotas para o centro do poço.
- Pipetar o adenovírus directamente sobre as ilhotas no centro do prato. Use 100-500 multiplicidades de infecção (MOI, a proporção de células alvo para virais unidades formadoras de placas).
- Deixe o resto ilhotas durante 5 min.
- Colocar a placa na incubadora de cultura de tecido (37 ° C, 5% de CO 2).
- Após 24 h, agite a placa para trazer as ilhotas para os centros dos poços e transferir as ilhotas utilizando uma micropipeta P200 para uma nova poços contendo meio fresco. Se as ilhotas tornar-se ligado à placa, eles podem ser desalojado suavemente com a ponta da pipeta.
[Nota: Para verificar eficiên transdução adequadacy, a utilização de um vírus de controlo expressando GFP é benéfico, tal como ilhotas pode então ser trabalhada por meio de microscopia confocal para verificar a penetração do adenovírus no núcleo das ilhotas.]
- Cultura das ilhotas para uma h 24-72 adicional, dependendo da temporização desejada do experimento a partir de estudos piloto de optimização. Por exemplo, a indução de uma resposta proliferativa podem exigir tempos que variam de 24-72 h ou knockdown do gene de interesse pode exigir 48 ou 72 horas. Transfira as ilhotas de mídia fresco todos os dias.
- Para a 24 h final da experiência, a cultura das ilhotas em meios contendo 1 uCi [metil-3 H] -thymidine/ml meios de comunicação (geralmente 1 uL de timidina / ml a media).
[Nota: A partir deste ponto em diante, siga protocolos institucionais para o manejo, uso e descarte de materiais radioativos.]
2. Teste de secreção de insulina
- Preparar otampão de secreção de ensaio (SAB) de solução stock de 10X (1,14 M de NaCl, 47 mM de KCl, 12 mM de KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO4) e CaCl 2 100X solução stock (0,25 M de CaCl2). Estas soluções de reserva pode ser preparado antecipadamente e guardado à temperatura ambiente.
- Recém-prepará 50 ml de ORS de trabalho (5 mL de SAB 10X, 1 ml de HEPES 1 M, 0,5 ml de 100X de CaCl2, 0,28 ml de BSA 35%, 0,11 g de NaHCO3, e água estéril para 50 ml) num 50-ml cónica do tubo e aquecido a 37 ° C, colocando em um banho-maria a 37 ° C.
- Pipetar 10 ml da ORS de trabalho para um tubo de 15 ml e adicionar 66,8 ul de 2,5 M D-glucose para preparar o glucose elevada (16,7 mM) SAB.
- Adicionar 44,8 ul de 2,5 M D-glucose ao ml restantes 40 da ORS de trabalho para preparar a glicose baixa (2,8 mM) SAB.
- Rotular três tubos de 1,7 ml de microcentrífuga para cada poço da placa de 6 poços e adicionar 1 ml de salino tamponado com fosfato (PBS). [Nota: Como as ilhotas são radioativos, siga protocolos institucionais para o manejo, uso e descarte de materiais radioativos.]
- Colocar 20 ilhotas em cada tubo de microcentrífuga. Fazer com que cada tentativa de adicionar ilhotas de tamanho comparável a cada tubo de microcentrífuga. Por exemplo, cada tubo pode conter 5 a médio, 10-, pequenas e 5 de grande porte ilhotas (ver Figura 1).
- Após as ilhotas se estabeleceram na parte inferior do tubo por gravidade (~ 2 min), aspirar o PBS com uma micropipeta e descartar.
- Para a pré-incubação, adicionar 400 uL da glu baixocose SAB, colocar os tubos (com as suas tampas abertas) para o tecido incubador de cultura (37 ° C, 5% de CO 2), e pré-incubar durante 60 min. Aspirar a pré-incubação baixa glicose SAB e descarte.
- Para a secreção de insulina basal, adicionar 400 uL da baixa glicose SAB, colocar os tubos (com as suas tampas abertas) para o tecido incubador de cultura (37 ° C, 5% de CO 2), e incubar durante 60 min. Recolher o baixo de glicose SAB e poupar para o radioimunoensaio de insulina.
- Para a secreção de insulina estimulada, adicionar 400 uL da alta glucose SAB, colocar os tubos (com as suas tampas abertas) para o tecido incubador de cultura (37 ° C, 5% de CO 2), e incubar durante 60 min. Recolher o alto de glicose SAB e poupar para o radioimunoensaio de insulina.
- Adicionar 1 ml de PBS; após as ilhotas ter assente no fundo do tubo, por gravidade, aspirar o PBS com uma micropipeta, descartar, e repetir estepasso uma vez.
- Adicionar 500 uL de gelo de ácido tricloroacético frio (TCA, 10% w / v) e incubar em gelo durante 30 min.
- Centrifugar os tubos a 16 000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Aspirar a ATC, adicionar 80 ul de 0,3 N NaOH, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Durante este tempo, vigorosamente vórtice as amostras para 5-10 s cada 10 min.
- Adicionar 4 ml de cocktail Econo-segura contagem para 7 ml tubos líquidos contagem de cintilação.
- Adicionar 50 ul da amostra para o tubo de contagem de cintilação, limitar o tubo, agitar brevemente, e contar num contador de cintilação líquida.
- Medir a concentração de proteína utilizando o ácido bicinconínico (BCA) de ensaio e 10 ul de amostra de acordo com o protocolo do fabricante.
- Realizar o radioimunoensaio insulina seguindo o protocolo do fabricante.
- Normalizar a secreção de insulina e os dados de incorporação de timidina com a proteína concentration.
[Nota: Islets pode ser visualizada usando um estereoscópio dissecando ou um microscópio padrão.]
[Nota: Como uma alternativa para a sedimentação por gravidade, os tubos podem ser centrifugado a 300 xg durante 1 min.]
3. Ensaio de Incorporação de timidina
4. Análise de Dados
5. Os resultados representativos
Um exemplo da experiência para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhotas de ratos é mostrado na Figura 2. Este exemplo mostra que a superexpressão adenoviral de "Gene # 6" hipotético robustamente estimula a replicação ilhota sem alterar a função das células beta. No painel superior, os resultados do ensaio de incorporação de timidina demonstrar que o aumento da expressão de "Gene # 6" aumenta a síntese de DNA, tal como medido pela incorporação de timidina. Como a maioria das células no ilhéu do rato são células beta, é provável que este aumento na incorporação de timidina indica um aumento da replicação das células beta. No entanto, as experiências de confirmação deve ser realizado para estabelecer firmemente este. No painel de fundo, os resultados do ensaio de secreção de insulina demonstrar que a superexpressão da "Gene # 6" não alterou uma das funções celulares primárias beta, isto é, insulin secreção de glicose baixa e alta. A qualidade do isolamento dos ilhéus e saúde dos ilhéus após o tratamento com adenovírus é indicado pelo aumento vezes na secreção de insulina em concentrações de glicose de baixa e alta. Se o aumento da expressão da função "Gene # 6" célula deficiente beta, este seria provavelmente como um decréscimo na insulina segregada em concentrações elevadas, estimuladores de glicose (16,7 mM). Uma curva dose-resposta para várias concentrações de glicose pode também ser realizada.
Figura 1. Geral de protocolo para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após adenoviral mediadas alterações na expressão do gene. Ilhotas de ratos recém-isoladas são expostos a adenovírus durante 24 horas e então cultivadas até 96 h. Incorporação de timidina são avaliados no 24 h final, seguido pela medição da secreção de insulina noglicose baixa e alta.
Figura 2. Os resultados de um experimento utilizando um adenovírus e controle de um adenovírus com superexpressão de um gene hipotético rotulados como "Gene # 6". O painel superior mostra a incorporação de timidina e do painel de fundo a secreção de insulina.
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Discussion
Vias, que estabelece que pode ser modulada para estimular a replicação e melhorar a função das células beta são relevantes para ambas as formas principais de diabetes. Devido massa celular funcional beta é dependente da existência e função de células secretoras de insulina, avaliando estes determinantes simultaneamente tem as suas vantagens. Este protocolo descreve um protocolo simplificado para identificar se a superexpressão ou supressão de uma proteína leva a alterações na massa funcional das células beta in vitro, que podem então ser testadas quanto à sua eficácia in vivo.
Uma limitação deste protocolo é que o ilhéu é um órgão de micro-consistindo de muitos tipos de células, incluindo mas não limitado a alfa, beta, delta, epsilon, e as células PP. Uma alteração na replicação dos ilhéus não pode traduzir completamente a uma mudança na replicação das células beta porque 80-90% das células na ilhota rato são células beta. A possibilidade de que uma mudança observada em ilhotareplicação é devido à não-beta a replicação celular existe. Assim, um passo lógico e de confirmação ao lado este protocolo pode ser examinando a replicação das células beta com a utilização de análogos da timidina acoplados a imunofluorescência ou análise de FACS 5,6. Esta análise de confirmação também pode aliviar a preocupação potencial de não-específica de incorporação de timidina em ilhotas independentes da proliferação.
Outra desvantagem reside no potencial da eficiência de transdução de adenovírus. A eficiência de transdução de 60-70% é razoável para conseguir, mas um factor determinante da eficácia é o momento da transdução adenoviral. É essencial para a cultura das ilhotas isoladas nas adenovírus o mais rapidamente possível para maximizar a eficiência de transdução. Dentro de algumas horas após o isolamento dos ilhéus do ilhéu começa a contrair, limitando assim a capacidade do adenovírus de penetrar profundamente no núcleo do ilhéu. A utilização de uma construção repórter, tais comoum GFP adenovírus expressando, acoplado com a microscopia confocal pode ser benéfico para avaliação da eficiência de transdução.
As principais vantagens deste protocolo são: 1) a eficiência de testes múltiplos determinantes da massa funcional das células beta no mesmo conjunto de ilhotas e 2) o pequeno número de ilhotas necessários para realizar o protocolo (um isolamento ilhéu típico rato produz 400 ilhotas) . Essas vantagens permitem que este protocolo para ser usado como uma ferramenta de triagem para genes múltiplos em um ritmo moderado.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão DK078732 do NIH (a FPT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
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