Denne protokollen gjør det mulig å identifisere faktorer som modulerer funksjonell beta cellemasse å finne potensielle terapeutiske mål for behandling av diabetes. Protokollen består av en strømlinjeformet metode for å vurdere holmen replikering og betacellefunksjon i isolerte rotte holmer etter manipulering av genuttrykk med adenoviruses.
Glukose homeostase er først og fremst styres av endokrine hormoner insulin og glukagon, skilles fra bukspyttkjertelen beta og alpha celler, henholdsvis. Funksjonell beta cellemasse bestemmes av den anatomiske beta cellemasse samt evne betacellene til å svare på et næringsstoff belastning. Et tap av funksjonell beta cellemasse er sentral i begge hovedformene av diabetes 1-3. Mens de fallende funksjonelle beta cellemasse resultater fra en autoimmun angrep i type 1 diabetes, i type 2 diabetes utvikler dette Decrement fra både en manglende evne til beta-cellene til å skille ut insulin riktig og ødeleggelse av betaceller fra en kadre av mekanismer. Dermed arbeidet med å restaurere funksjonell beta cellemasse er ytterst viktig for bedre behandling av og potensielle botemidler for diabetes.
Det arbeides med å identifisere molekylære mekanismer som kan utnyttes til å stimulere replikering og forbedre funksjonen av beta-cellene.Ideelt sett ville terapeutiske mål å forbedre både beta cellevekst og funksjon. Kanskje mer viktig om er å identifisere om en strategi som stimulerer beta cellevekst kommer på bekostning av svekke betacellefunksjon (for eksempel med noen onkogener) og vice versa.
Ved systematisk å undertrykke eller overekspresjon uttrykket av målgener i isolerte rotte holmer, kan man identifisere potensielle terapeutiske mål for å øke funksjonell beta cellemasse 4-6. Adenoviral vektorer kan brukes til å effektivt overuttrykker eller knockdown proteiner i isolerte rotte holmer 4,7-15. Her presenterer vi en metode for å manipulere genuttrykket utnytte adenoviral transduksjon og vurdere holme replikering og betacellefunksjon i isolerte rotte holmer (figur 1). Denne metoden har blitt brukt tidligere til å identifisere nye mål som modulerer beta cellen replikering eller funksjon 5,6,8,9,16,17.
Etablering veier som kan være modulert å stimulere replikering og forbedre funksjonen av beta-cellene er relevante for både store former for diabetes. Fordi funksjonell beta cellemasse er avhengig av eksistens og funksjon av insulin-sekresjon celler, vurdere disse determinantene har samtidig sine fordeler. Denne protokollen beskriver en strømlinjeformet protokoll for å identifisere hvorvidt overuttrykte eller undertrykkelse av et protein fører til endringer i funksjonell beta cellemasse in vitro, som dere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av stipend DK078732 fra NIH (til PTF).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
[methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
NaCl | Sigma | 59888 | |
KCl | Acros | 42409 | |
KH2PO4 | Acros | 20592 | |
MgSO4 | Acros | 41348 | |
CaCl2 | Acros | 34961 | |
HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
35% BSA | Sigma | A7979 | |
NaHCO3 | Acros | 42427 | |
d-glucose | Sigma | G8769 | |
TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
NaOH | Acros | 12426 | |
Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |