Summary
Denne protokollen gjør det mulig å identifisere faktorer som modulerer funksjonell beta cellemasse å finne potensielle terapeutiske mål for behandling av diabetes. Protokollen består av en strømlinjeformet metode for å vurdere holmen replikering og betacellefunksjon i isolerte rotte holmer etter manipulering av genuttrykk med adenoviruses.
Abstract
Glukose homeostase er først og fremst styres av endokrine hormoner insulin og glukagon, skilles fra bukspyttkjertelen beta og alpha celler, henholdsvis. Funksjonell beta cellemasse bestemmes av den anatomiske beta cellemasse samt evne betacellene til å svare på et næringsstoff belastning. Et tap av funksjonell beta cellemasse er sentral i begge hovedformene av diabetes 1-3. Mens de fallende funksjonelle beta cellemasse resultater fra en autoimmun angrep i type 1 diabetes, i type 2 diabetes utvikler dette Decrement fra både en manglende evne til beta-cellene til å skille ut insulin riktig og ødeleggelse av betaceller fra en kadre av mekanismer. Dermed arbeidet med å restaurere funksjonell beta cellemasse er ytterst viktig for bedre behandling av og potensielle botemidler for diabetes.
Det arbeides med å identifisere molekylære mekanismer som kan utnyttes til å stimulere replikering og forbedre funksjonen av beta-cellene.Ideelt sett ville terapeutiske mål å forbedre både beta cellevekst og funksjon. Kanskje mer viktig om er å identifisere om en strategi som stimulerer beta cellevekst kommer på bekostning av svekke betacellefunksjon (for eksempel med noen onkogener) og vice versa.
Ved systematisk å undertrykke eller overekspresjon uttrykket av målgener i isolerte rotte holmer, kan man identifisere potensielle terapeutiske mål for å øke funksjonell beta cellemasse 4-6. Adenoviral vektorer kan brukes til å effektivt overuttrykker eller knockdown proteiner i isolerte rotte holmer 4,7-15. Her presenterer vi en metode for å manipulere genuttrykket utnytte adenoviral transduksjon og vurdere holme replikering og betacellefunksjon i isolerte rotte holmer (figur 1). Denne metoden har blitt brukt tidligere til å identifisere nye mål som modulerer beta cellen replikering eller funksjon 5,6,8,9,16,17.
Protocol
1. Adenoviral Transduksjon og dyrkning av Rat Holmer
- Forbered en 6-brønnen ikke-vevskultur belagt plate ved å legge 2 ml media (RPMI 1640 medier som inneholder 8 mm glukose, 10% fosterets bovint serum, 50 enheter / ml penicillin, og 50 mikrogram / ml streptomycin) til det nødvendige antall brønner. For eksempel kan en typisk eksperiment krever tre brønner - én hver for et nei-virus kontroll, et virus kontroll (f.eks GFP-uttrykke adenovirus), og den eksperimentelle gruppen.
- Varm opp platen til 37 ° C ved å plassere det inn i en vev kultur inkubator for minst 30 min.
- Umiddelbart etter rotte holme isolasjon 18,19, sted 100-200 holmer i individuelle brønner på den 6-brønnen ikke-vevskultur belagt plate. Seksti holmene er nødvendig for insulin sekresjon og tymidin inkorporering analyser. De resterende holmer kan brukes for RNA isolering for genekspresjon studier eller protein isolasjon for immunoblotting.
[Merk: Fra dette punktet fremover, følg institusjonelle protokoller for håndtering, bruk og avhending av biologisk materiale.]
- Roter forsiktig platen å bringe holmer til sentrum av brønnen.
- Pipettering av adenovirus direkte på holmene i sentrum av fatet. Bruk 100-500 multiplicities for infeksjon (MOI, forholdet mellom målcellene til viral plakk-forming units).
- La holmer hvile i 5 min.
- Sett platen i vevet kulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
- Etter 24 h, forsiktig virvel platen å bringe holmer til sentre for brønnene og overføre holmene ved hjelp av en P200 mikropipette til en ny brønn inneholder ferske media. Hvis holmene blir festet til plate, kan de forsiktig forskyves med pipettespissen.
[Merk: For å bekrefte tilstrekkelig transduksjon efficiency, bruk av en kontroll virus som uttrykker GFP er gunstig, så holmer kan da bli fotografert via konfokalmikroskopi å verifisere penetrering av adenovirus inn holmen kjerne.]
- Kultur holmer for en ekstra 24-72 timer, avhengig av ønsket tidspunkt for eksperimentet fra optimalisering pilotstudier. For eksempel kan induksjon av en proliferativ respons kreve ganger strekker 24-72 t eller knockdown av genet av interesse kan kreve 48 eller 72 timer. Overfør holmene for å friske media hver dag.
- For den endelige 24 h av eksperimentet, kultur holmer i media inneholder en μCi [metyl-3 H] -thymidine/ml media (vanligvis 1 mL tymidin / ml media).
[Merk: Fra dette punktet fremover, følg institusjonelle protokoller for håndtering, bruk og avhending av radioaktivt materiale.]
2. Insulinsekresjon Assay
- Klargjørsekresjon analysen buffer (SAB) 10X stamløsning (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO 4) og CaCl 2 100X stamløsning (0,25 M CaCl 2). Disse lager løsninger kan være forberedt på forhånd og oppbevares i romtemperatur.
- Tilbereder 50 ml av den arbeidende SAB (5 ml 10X SAB, 1 ml av 1 M HEPES, 0,5 ml av 100X CaCl 2, 0,28 ml av 35% BSA, 0,11 g NaHCO 3, og sterilt vann til 50 ml) i en 50-ml konisk rør og varmt til 37 ° C ved å plassere i en 37 ° C waterbath.
- Pipetter 10 ml av den arbeidende SAB til en 15-ml konisk rør og tilsett 66,8 mL av 2,5 M D-glukose for å forberede den høye glukose (16,7 mM) SAB.
- Legg 44,8 mL av 2,5 M D-glukose til de resterende 40 ml av arbeids SAB å forberede lav glukose (2,8 mm) SAB.
- Etiketten tre 1,7-ml Mikrosentrifugerør for hver brønn på seks-brønns plate og tilsett 1 ml av fosfat-bufret saltvann (PBS). [Merk: Som holmene er radioaktiv, følg institusjonelle protokoller for håndtering, bruk og avhending av radioaktivt materiale.]
- Plasser 20 holmer i hvert mikrosentrifuge rør. Gjør hver forsøk på å legge til sammenlignbare størrelser holmer til hvert mikrosentrifuge rør. For eksempel kan hver tube inneholde fem små, 10 medium-, og 5 av store holmer (se figur 1).
- Etter at holmene har avgjort på bunnen av røret ved hjelp av tyngdekraften (~ 2 min), aspirer PBS med en mikropipette og kast.
- For pre-inkubering, tilsett 400 mL av den lave Glucose SAB, plasserer rørene (med luene åpen) i vevet kulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO 2), og pre-inkuber i 60 min. Aspirer pre-inkubering lav glukose SAB og kast.
- For basal insulin sekresjon, tilsett 400 mL av den lave glukose SAB, plasserer rørene (med luene åpen) i vevet kulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO 2), og inkuber i 60 min. Samle lav glukose SAB og lagre for insulin radioimmunoassay.
- For stimulert insulinsekresjon, tilsett 400 mL av den høye glukose SAB, plasserer rørene (med luene åpen) i vevet kulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO 2), og inkuber i 60 min. Samle den høye glukose SAB og lagre for insulin radioimmunoassay.
- Tilsett 1 ml PBS, etter at holmene har avgjort på bunnen av røret av tyngdekraften, aspirer PBS med en mikropipette, kaste, og gjenta dettetrinn en gang.
- Legg til 500 mL iskald trikloreddiksyre (TCA, 10% w / v) og inkuberes på is i 30 min.
- Sentrifuger rørene på 16 000 xg i 3 min ved 4 ° C.
- Aspirer TCA, tilsett 80 mL av 0,3 N NaOH, og Inkuber i 30 min ved romtemperatur. I løpet av denne tiden, kraftig vortex prøvene i 5-10 s hvert 10 min.
- Tilsett 4 ml Econo-safe telling cocktail til 7 ml flytende scintillation telle rør.
- Tilsett 50 mL av prøven til scintillation telle tube, lue røret, rist kort, og teller i en væske scintillation teller.
- Mål proteinkonsentrasjonen med bicinchoninic syre (BCA) assay og 10 mL av prøven i henhold til produsentens protokollen.
- Utfør insulin radioimmunoassay følge produsentens protokollen.
- Normalisere insulin sekresjon og tymidin inkorporering data med protein konsentration.
[Merk: Holmer kan visualiseres ved hjelp av enten en dissekere stereoscope eller en standard mikroskop.]
[Merk: Som et alternativ til settling av tyngdekraften, kan rørene være sentrifugeres ved 300 xg i 1 min.]
3. Thymidine Incorporation Assay
4. Data Analysis
5. Representative Resultater
Et eksempel på forsøket å vurdere holmen replikering og betacellefunksjon i rotte holmer er vist i figur 2. Dette eksempelet viser at adenoviral overuttrykte hypotetiske "Gene # 6" robust stimulerer holme replikasjon uten å endre betacellefunksjon. I den øverste panelet, resultatene fra den tymidin inkorporeringen analysen viser at økt uttrykk av "Gene # 6" øker DNA-syntese, målt ved inkorporering av tymidin. Fordi de fleste av cellene i rotte holmen er betaceller, er det sannsynlig at denne økningen i tymidin innlemmelse indikerer en økning i beta celle replikering. Imidlertid må bekreftende eksperimenter utføres for å befeste denne. På den nederste delen, resultatene fra den insulinsekresjon analysen viser at overuttrykte "Gene # 6" endret ikke en av de viktigste beta cellefunksjoner, dvs. jegnsulin sekret ved lav og høy glukose. Kvaliteten på holmen isolasjon og helse av holmene etter behandling med adenoviruses indikeres av fold økning i insulinutskillelsen ved lave og høye glukose konsentrasjoner. Ved økende uttrykk for «Gene # 6" nedsatt betacellefunksjon, ville dette trolig bli reflektert som en reduksjon i insulin skilles ved høye, stimulerende glukosekonsentrasjoner (16,7 mm). En dose-respons kurve for varierende glukosekonsentrasjoner kan også utføres.
Figur 1. Oversikt over protokollen for å vurdere holmen replikering og betacellefunksjon i isolerte rotte holmer etter adenoviral-medierte endringer i genuttrykk. Fersk isolert rotte holmene er utsatt for adenoviruses i 24 timer og deretter dyrkes opp til 96 timer. Thymidine innlemmelse vurderes i den endelige 24 timer, etterfulgt av måling av insulinsekresjon vedlav og høy glukose.
Figur 2. Resultater fra et eksperiment ved hjelp av en kontroll adenovirus og en adenovirus overekspresjon en hypotetisk gen merket som "Gene # 6". Den øverste panelet viser tymidin innlemmelse og bunnpanelet den insulinutskillelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etablering veier som kan være modulert å stimulere replikering og forbedre funksjonen av beta-cellene er relevante for både store former for diabetes. Fordi funksjonell beta cellemasse er avhengig av eksistens og funksjon av insulin-sekresjon celler, vurdere disse determinantene har samtidig sine fordeler. Denne protokollen beskriver en strømlinjeformet protokoll for å identifisere hvorvidt overuttrykte eller undertrykkelse av et protein fører til endringer i funksjonell beta cellemasse in vitro, som deretter kan bli testet for effekt in vivo.
En begrensning av denne protokollen er at holmen er en mikro-organ bestående av mange celletyper, inkludert men ikke begrenset til alfa, beta, delta, epsilon, og PP celler. En endring i holmen replikering kanskje ikke helt oversette til en endring i beta celle replikering fordi 80-90% av cellene i rotte holmen er betacellene. Muligheten for at en observert endring i holmereplikering skyldes ikke-beta celle replikering eksisterer. Dermed kan en logisk og bekreftende neste skritt i denne protokollen skal undersøke beta celle replikering med bruk av tymidin analogs koblet til immunfluorescens eller FACS analyse 5,6. Dette bekreftende analyse kan også lindre potensialet bekymring for uspesifikk tymidin innlemmelse holmer uavhengig av spredning.
En annen potensiell ulempe ligger i transduksjon effektiviteten av adenoviruses. En transduksjon virkningsgrad på 60-70% er rimelig å oppnå, men en viktig determinant av effektiviteten er tidspunktet for adenoviral transduksjon. Det er viktig å kulturen de isolerte øyer i adenoviruses så snart som mulig for å maksimere transduksjon effektivitet. I løpet av noen timer etter at holmen isolasjon holmen begynner å kontrakt, og dermed begrense muligheten av adenovirus å trenge dypt inn i kjernen av holmen. Bruken av en reporter konstruksjon, for eksempelen adenovirus uttrykker GFP, kombinert med konfokalmikroskopi kan være fordelaktig for evaluering transduksjon effektivitet.
De primære fordelene av denne protokollen er: 1) effektivisering av testing av flere determinanter for funksjonell beta cellemasse på samme pool av holmer og 2) de små antall holmer som kreves for å utføre protokollen (en typisk rotte holme isolasjon gir 400 holmer) . Disse fordelene gjør denne protokollen som skal brukes som en screening verktøy for flere gener på et moderat tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend DK078732 fra NIH (til PTF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR | |
References
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O'Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O'Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
