Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

doi: 10.3791/4094 Published: November 17, 2012

Summary

Biz kayıt ve sayısal bir video-hızı izleme mikroskop sistemi geliştirdik

Abstract

Biz C. lokomotor davranışları ölçmek için enstrümantasyon, görüntü işleme ve veri analiz teknikleri geliştirdiler elegans bir agar plaka yüzeyi üzerinde tarama gibi. Davranış, C. genetik, biyokimyasal ve nöronal temelini çalışma için Bu mikroskop mükellef, genetik uysal ve taksiler, öğrenme ve sosyal etkileşim 1,2 dahil olmak üzere karmaşık davranışlar, bir dizi gösterir çünkü elegans ideal bir organizmadır. Onlar agar plaklarına sürün solucanlar hareketleri izlemeye dayalı Davranış analizi duyusal davranışları 3, lokomosyon 4, ve genel mutasyonel fenotipleme 5 çalışmada özellikle yararlıdır olmuştur. Sistemimiz solucanlar hiçbir mekanik uyarana solucan iletilir sağlayan sabit bir agar plaka üzerinde taradığı gibi kamera ve aydınlatma sistemi hareket ettirerek çalışır. Bizim izleme sistemi kullanımı kolay ve yarı-otomatik kalibrasyon özelliği içerir. Bir chatüm video izleme sistemlerinin llenge bunu boyutlu özünde yüksek veri büyük miktarda üretir olmasıdır. Bizim görüntü işleme ve veri analiz programlarının kapsamlı sadece 3-4 boyutları 6,7 fonksiyonu olarak solucanlar davranışı yeniden bağımsız bileşenler, bir dizi içine solucan şekli azaltarak bu meydan başa. Işleminin bir örnek olarak, sonsuz dişli bir faz özel bir şekilde onun ters durumuna girer ve çıkar olduğunu göstermektedir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Takip Mikroskop Açıklaması

  1. Bir agar bir fiber ışık kaynağı tarafından aydınlatılır ve bir kamera ile görüntülenir. Bu sistem, X, Y çeviri aşama için monte edilir.
  2. Sahne bir step motor denetleyicisine bağlı olan standart step motorları tarafından taşınır.
  3. Denetleyici ve kamera bilgisayara bağlı ve LabVIEW yazılmış özel programlar tarafından kontrol edilir.
  4. Kamera görüntüleri bir agar plaka yüzey ve hafif bir arka plan üzerine koyu nesneleri tanımlar.
  5. Bilgisayar programı gerçek zamanlı olarak herhangi bir nesne ölçmek böylece görüntü kalitesi ayarlanır. Kazanç, parlaklık ve kameranın çekim hızı beyaz bir arka plan üzerinde koyu bir nesne sağlamak için ayarlanabilir.
  6. Otomatik kalibrasyon işlemi için bir kalibrasyon işareti bir solucan kıracağıyla agar yüzeyini alay tarafından yapılır.
  7. Izleme programı tarafından kullanılan filtre, ikili resmi kontrol edilebilir.
  8. Öylesineftware bir test nesne sabit bir mesafe hareket ettirerek kalibrasyon matrisi hesaplayan otomatik kalibrasyon özelliğine sahiptir.
  9. Piksel Mesafeler kalibrasyon matrisi step motor tarafından atılan adımların kalibre edilmektedir.
  10. Kalibrasyon sonra sistem gitmek için hazır olduğunu ve büyütme değiştirilmediği sürece veya kameranın yönü değiştirilmiş ise yeniden kalibre edilmesi gerekmez.

2. Takip Tabaklar ve C. hazırlanması Takip için elegans

  1. Bir bakır halka solucanlar ağıl ve plakasının kenar geçme onları tutmak için kullanılır. Bakır, yerel bir kimyasal bir engel oluşturur ve deney (<1 saat) süreleri için başka solucan hareket etkilemez. Bir ısı bloğu veya eşdeğer yerleştirerek ilk halkası ısıtın.
  2. Taze bir agar plakası üzerine il halkası (% 1.7 Bacto Agar,% 0.25 'lik Bacto-pepton,% 0.3 NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM potasyum fosfat tamponu, 5 ug / mlkolesterol) ve agar yüzeyinden içine gömmek için hafifçe bastırın.
  3. Yemek artıklarını onları yıkamak için bazı NGM tamponu (% 0.3 NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM potasyum fosfat tamponu) ile dolu bir agar plaka üzerine L4 evre veya genç erişkin solucanlar seçin. Solucanlar birkaç dakika yüzmek edelim.
  4. Dikkatle halkanın merkezine yakın izleme plaka üzerine tek bir solucan yerleştirin. Ve sonra solucanı izci üzerine plakası yerleştirin.

3. Solucan Takibi

  1. LabVIEW programı çalıştırın ve gerekirse (görüntüler için konum, resimler, ölçümler, kamera ayarları türleri) seçeneklerini belirleyin.
  2. Joystick solucanın bir görüntü kadar mikroskop hareket kullanarak görüş alanı (bilgisayar ekranında) bulunmaktadır. Izleme program yapmaya "parça" tuşuna basın.
  3. Bilgisayar programı aslında görüldüğü gibi bir ikili filtrelenen görüntüleri hareketlerini ölçer ve gerçek zamanlı olarak bu görüntü üzerinde ölçümler yapabilir
  4. Kıçtasolucanı lokal şekil değişiklikleri ayrıntılı olarak görülebilir ve küresel yörünge bir yeniden izleme er, kademeli motor hareketlerine yapılabilir.

4. Veri Analizi

  1. Solucanın şekilleri parametreleştirmek skeletonizing betik (MATLAB) çalıştırın. (Şekil 2)
  2. Iskeletize veri eigenmodes hesaplayın. (Şekil 3,4)
  3. Şekil 5 göster. Şekildeki açıklayıcı veya temsilci sonuçları okuyun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Örnek: yem, C. elegans geçişler ileriden genellikle ileri hareket durumuna dönmeden önce bir uyarlanmasını (omega dönüş) gerçekleştirirken, hareket ters. Bu geçiş nicel hareket toplayıcılık desen anlamak ve aynı zamanda solucan motor kontrolü önemlidir. Lokomosyon davranış ince ayrıntılarını ortaya çıkarmak için güç bizim izci cihaz kullanılarak görülebilir.

Bir örnek olarak ters ve ~ 30 dakika agar plaka üzerinde serbestçe sürünerek solucanlar yüksek çözünürlüklü fotoğraf çekimi ile geçiş iletmek için ters ileriye bakmak. çalıştırır. Eigenmode analizi (Şekil 3) bize solucanın dalgalı hareketlerin faz ölçmek için sağlar. Sırayla faz ölçümü bizi solucan ve geçiş (Şekil 4) ters ileri hızını hesaplamak için izin verir. Solucan hız ve faz ortak olasılık komplo, biz bu trans görebilirsinizileri ve ters bir tercihli aşaması (Şekil 5a) ile olasılıksal gerçekleşmesi arasındaki ition. Biz tersine çevirmek ve geçişler iletmek ve bir ters olay girer ve çıkar solucan aşamasının koşullu olasılık bakmak ters ileri birbirinden ayırırsanız, onlar farklı faz dağılımları (Şekil 5b, c) sahip olduğunu görüyoruz.

Şekil 1
Şekil 1. Mikroskobu takibi. Görüntüleme sistemi görünümün merkezinde solucan tutmak için hareket ederken bir agar plaka üzerinde sürünen bir solucan örnek sabit kalır. Görüntüleme sistemi step motorlar (3) tarafından yönlendirilen bir 2D çeviri sahnede inşa edilmiştir. Bir CCD kamera (Basler A601f) ve lens (25mm odak uzaklığı) görüntüleri aşağıdan solucan (1) ve bir fiber ışık (Edmunds optik; modeli) (2) yukarıdan onu aydınlatır. Bir basit kullanan ev yapımı bir step motor kontrolep denetleyici kartı (SimpleStep; SSXYZ) görüntüleme sisteminin hareketini kontrol eder. Eşzamanlı alanın merkezinde solucan tutmak için motor denetleyicisi ile iletişim sırasında bir özel LabVIEW programı (National Instruments, Austin, TX, ABD), solucanlar görüntüleri alır ve işler.

Şekil 2,
Şekil 2. Görüntü işleme. (A) Worms zamanda onların eğrilik değiştirerek taşıyın ve böylece biz onların merkez hattı parameterizing tarafından solucan görüntüler işlenir. Görüntüler ham gri skala görüntüsü (b) thesholding tarafından ikili yapılmış ve bireysel solucanlar boyutu (c) nesneleri filtreleyerek belirlendi. Solucanı kütle merkezi ve görüntü merkezi arasındaki uzaklık yeniden merkez wo uygun mesafeler hesaplanmış ve daha sonra aşama taşındırm. Bu düzeltme mesafeler solucanın yörüngesini hesaplamak için kullanılmıştır. Solucan çevresinin eğrilik kuyruk (maksimum eğrilik) ve baş (ikincil maksimum) kullanılarak tespit edilmiştir. (D) Bundan sonra görüntülerin merkez hattı bulmak için iskeletlendirildi edildi. (E) Elde edilen eğri sonra sonra 101 parçaya interpolasyon ve segmentler arasındaki hesaplanan açı eğrisi parameterize için kullanılmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. Eigenmode hesaplama. Solucan şekli Temel eğrileri Temel Bileşen Analizi 5 kullanılarak hesaplanmıştır. Her bir solucan eğri özvektörlerin doğrusal bir miktar (ya da eigenworms) ile temsil edilir, burada Her bileşenlerinin genliği eigenmode (mod) olarak bilinir. Zaman içinde solucan şekil ilk 3 eigenmodes ölçülerek solucan davranışını miktarı tayin edilebilir.

Şekil 4,
Şekil 4. Faz ve hız. Bir sınırı döngüsü için ilk iki mod (a) ortak dağılımı. (B) bu sınırı döngüsü evresi veya pozisyon solucanın dalgalıdır konumunun faz ile ilişkilidir. (C) solucanlar ileri faz hızı kullanma ve geri hareketleri ölçülebilir. (D) Bu sınır döngüleri boyunca hızı ve yönü solucanın hızı gösterir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

4094fig5.jpg "alt =" Şekil 5 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/4094/4094fig5highres.jpg "/>
Şekil 5. Aşama bağımlı hız anahtarlama. Ileri ve geri devletler arasındaki geçişler salınımlı döngüsü boyunca rastgele olmaz. Onlar (ancak yine de stokastik) belirli evrelerinde olur. (A) faz hızı ve hız ortak dağılım açıkça solucanlar belirli aşamalarında tercihen ileri devlet bırakmak ve girmek olduğunu gösterir. (B) bir ters olay girişinde şartına evresinin bir komplo gösterir. (C) bir geri dönüş olayı çıkış şartıyla faz göstermektedir. Siyah çizgi bir çıkış ya da girişinde klima olmadan faz açıları dağılımıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lokomosyon ve doğal davranış çalışmada veri azaltma teknikleri ile ortak non-invazif izleme teknikleri gerektirir. Burada C. detaylı görüntülerini kaydeden izleme sistemi kullanımı kolay göstermiştir bir agar plaka yüzeyi üzerinde tarama gibi elegans davranış. Bu görüntülerin içerdiği bilgi miktarı büyük ve yüksek boyutlu olduğunu ve bu yüzden de sadece dört temel tedbirleri içine veri boyutluluğu azaltmak için yöntemler geliştirmişlerdir. Bu önlemler kapsamlı ve solucan davranışı açısından yorumlamak kolaydır. Bu çalışma için biz ileriye ve geriye kendi dalgalıdır döngüsünün farklı noktalarında, göz ile yapmak zor bir ölçü de tercihen devletler arasındaki solucanlar geçiş gösterir. Bu çalışma ölçebilen veya nöronal devreye modüle sistemleri de düşük büyütme 8,9,10 at solucanlar davranışını ölçmek için geliştirilmiştir izleme sistemleri için tamamlayıcı vegenetik olarak kodlanmış reaktifler 11,12 kullanarak vitesi.

Tek bir organizma izleme davranışının ölçümü için güçlü bir yöntem olmasına rağmen tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Ilk olarak, sistemden bir defada sadece tek bir organizma parça olmasıdır. Birden organizmalar 9,10 takip edebiliyoruz sabit kamera izci ile karşılaştırıldığında, bizim izci verimini düşüktür. Ancak, açlık, yumurtlama ve toplayıcılık gibi uzun zaman ölçeğinde davranışlarının ölçülmesi için önemli multi-solucan izci, daha zaman çok daha uzun süreler için tek bir organizmanın davranışı ölçmek mümkün. Ayrıca izci açıkça arka plan solucanı tespit görüntüleri gerektirir. Bu solucan filtrelemek için görüntü işleme sistemi için görsel darmadağın veya başka çok karmaşık ortamlarda solucan hareketlerini inceleyerek bizi engellemektedir.

Bu sistem, esnek ve davranışına diğer türleri için de kullanılabilirOral izleme. Bunun yerine homojen bir ortamda diğer izleme sistemlerine benzer uzaysal ve zamansal duyusal bilgileri, teslim ederken, solucan izlenebilir. Örneğin, termal uyarıcı lazer uyarıcı 7,14 ile uygulanabilir, veya kimyasal bilgi agar ile 3 arasındaki uzaysal gradyanları vasıtasıyla uygulanabilir. Bir bütün olarak sistemin tasarımı esnektir ve bu gibi Drosophila larvalarının gibi diğer tarama sistemleri ile de kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCD camera Basler A601f
Lens Edmund Optics MMS series
Fiber Illumination Dolan Jenner DC-950H
Translation stage Deltron LS3-4
Stepper Motor US digital MS23C
Stepper motor drive Gecko G201
Stepper motor control SimpleStep SSXYZ
All programming code is available. Please send a request email to the corresponding author.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19, (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118, (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4, (1), e1000028 (2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5, (11), e13914 (2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115 (2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3, (5), e2208 (2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187, (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (18), 10477-10482 (1999).
<em>C. elegans</em> Takip ve Davranış Ölçme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).More

Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans Tracking and Behavioral Measurement. J. Vis. Exp. (69), e4094, doi:10.3791/4094 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter