Summary
Vi viser en protokoll der administrasjon av gentoksisk stoff azoxymethane (AOM) etterfulgt av tre sykluser av pro-inflammatorisk agent dekstransulfat natrium (DSS) raskt og konsekvent genererer tykktarmskreft hos mus med morfologiske og molekylære likheter til de som er sett i menneskelig kolitt -assosiert kreft.
Abstract
Personer med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), slik som Crohns sykdom (CD) eller ulcerøs kolitt (UC) har økt risiko for å utvikle kolorektal kreft (CRC) over friske individer. Denne risikoen er proporsjonal med varigheten og omfanget av sykdommen, med en kumulativ insidens så høyt som 30% i individer med langvarig UC med utbredt colonic engasjement. 1 Colonic dysplasi i IBD og kolitt assosiert kreft (CAC) antas å utvikle seg som et resultat av gjentatte sykluser av epitelcelleopprinnelse skade og reparasjon mens disse cellene er badet i en kronisk inflammatorisk cytokin miljø. 2 Mens spontane og kolitt-assosiert kreft dele kvaliteten av å være adenocarcinomas, blir sekvensen av underliggende molekylære hendelser antas å være annerledes. 3 Denne skillet argumenterer behovet for spesifikke dyremodeller av CAC.
Flere musemodeller dag eksisterer for studiet av CAC. Dekstransulfat Sodium (DSS), en agent med direkte toksiske effekter på tykktarmsområdet epitel, kan administreres i drikkevann til mus i flere sykluser for å skape en kronisk inflammatorisk tilstand. Med tilstrekkelig varighet, vil noen av disse musene utvikler svulster. 4 Tumor utvikling er fremskyndet i denne modellen hvis administreres i en pro-kreftfremkallende setting. Disse inkluderer mus med genetiske mutasjoner i tumorigenesis trasé (APC, p53, Msh2) samt mus forbehandlet med genotoksiske midler (azoxymethane [AOM], 1,2-dimethylhydrazine [DMH]). 5
Kombinasjonen av DSS med AOM som modell for kolitt assosiert kreft har vunnet popularitet for sin reproduserbarhet, styrke, lav pris, og brukervennlighet. Selv om de har en felles mekanisme, har AOM blitt funnet å være mer potent og stabil i løsning enn DMH. Mens tumor utvikling i andre modeller generelt krever flere måneder, mus injisert med AOM og deretter behandlet med DSS utvikle adekvate svulster i ens lite som 7-10 uker. 6, 7 Endelig AOM og DSS kan administreres til mus av noen genetisk bakgrunn (knock out, transgene, etc.) uten kryss-avl til en bestemt svulstfremkallende belastning. Her viser vi en protokoll for betennelse-drevet colonic tumorigenesis i mus som benytter en enkelt injeksjon av AOM etterfulgt av tre syv-dagers sykluser av DSS over en 10 ukers periode. Denne modellen induserer svulster med histologiske og molekylærbiologiske forandringer tett likner de som forekommer i menneskelig CERT og gir en svært verdifull modell for studiet av oncogenesis og Kjemoprevensjon i denne sykdommen. 8
Protocol
1. Kolitt-assosiert induksjon av kreft
- Sett til side bur av kjønn og alder-matchet 6-8 uker gamle mus som skal brukes til eksperimentelle og kontroll grupper. Mus kan være individuelt merket med hale markeringer eller øre klipp.
- På dag 0, posten baseline vekter og injisere hver mus intraperitonealt (IP) med 10 mg / kg av AOM arbeidsoppløsning (1 mg / ml i isotonisk saltvann, fortynnet fra 10 mg / ml stamoppløsning i dH2O holdt ved -20 ° C) . Basert på erfaring, kan denne dosen justeres mellom 7-14 mg / kg og / eller gjentatt tidlig i forsøket.
Forsiktig: AOM er et flyktig gentoksisk stoff og bør håndteres forsiktig i henhold til medfølgende HMS-datablad. Fortynninger bør være forberedt på en kjemisk hette, vedlikeholdes på is, og forkastet etter institusjon spesifikke protokoller.
- Lage en 2,5% (2,5 g/100 ml) DSS oppløsning i destillert vann og passerer gjennom et 0,22 um celluloseacetat fIlter med støvsuger. Denne dosen kan justeres mellom 1 til 3,5% avhengig mus belastning og miljø. Etter tilberedning DSS løsning kan holdes nedkjølt i opptil 1 uke.
- På dag 7, forsyning DSS løsning til mus som deres drikkevann. Ca 250 ml / bur vil være nødvendig hver gang nytt DSS er gitt for et maksimalt 5 mus / bur, men disse er bare estimater og vil variere avhengig av hvilken type vannflasker brukes i dyret anlegget.
- Å gi en kontinuerlig tilførsel av DSS i syv dager, bør DSS løsning erstattes i rene flasker tre ganger (hver 2-3 dager) i denne perioden. Noen undersøkere måle mengden DSS forbrukes før erstatte med ny løsning som mål på eksponering.
- På dag 14, bytte bur tilbake til standard drikkevann i to uker.
- Gjenta trinnene (1,4) - (1,6) på dager tjueåtte og 49 å tilveiebringe en andre og tredje syklus av DSS. En DSS "syklus" består av én uke av DSS i drikkevannetetterfulgt av 2 uker med regelmessig (autoklaverte) vannet.
2. Klinisk vurdering Kolitt og tumorprogresjon
- Mus skal veies / observert 2-3 ganger per uke. Prosent vekttap forhold til baseline brukes som et surrogat mål på kolitt alvorlighetsgrad. Regelmessig vurdering av rektal blødning, diaré, eller prolaps kan gjøres avhengig av eksperimentelle mål og rapportert i henhold til ulike scoring. 9, 10
- Et vekttap på opp til 10% sammen med 2-3 dager med diaré og rektal blødning kan forventes i uken etter en full syklus av DSS (daglig observasjon kan være nyttige under denne umiddelbare post-DSS periode).
Det er mulig at noen mus ikke kan komme, mus miste mer enn 20% av vekten deres er mindre sannsynlighet for å overleve, og kan kreve tidlig dødshjelp. En enkelt IP injeksjon på 0,5 - 1,0 ml saltvann i slike mus kan være en nyttig støttende tiltak mot korrigere flui d volumet tapt på grunn av diaré.
3. Murine Endoskopi (valgfritt)
- Endoskopi etter den andre eller tredje syklus av DSS utføres for å bekrefte tumorvekst in vivo før avlivelse. Som AOM / DSS modellen er ganske pålitelig i produserende svulster, er dette trinnet generelt ikke nødvendig. Bare noen få mus bør vurderes å bruke denne metoden, som den har potensial til å forstyrre mus svulster. 11
- Anesthetize musen med inhalert eller injiserbare sedasjon.
- Etter mus er bedøvet, sikre musen til en flat bord med tape på halen og brystet.
- Fremme murine endoskopet i musen endetarmen forsiktig med saltvann for å blåse og vanne å forbedre intraluminal visning og fjerne fecal innholdet. (Merk at endoskopi kan også utføres ved hjelp av luft innblåsning som et alternativ til saltvann og denne teknikken kan tilby forbedret visualisering av svulsten. 12)
- På dag 70, skal hver AOM / DSS behandlet mus havn flere tykktarmskreft og være klar for vurdering. Denne datoen kan bli forsinket uker til måneder hvis større svulster er ønskelig. (Av notatet, kan mus med alvorlig endetarms prolapsed må avlives tidlig for å unngå overdreven ubehag for dyrene som per institusjonelle dyr omsorg komiteer.)
- Før obduksjon individuelt avlive mus med isofluran og cervical forvridning (eller annen institusjonelt-godkjent metode). Endelige vekt og andre målinger kan gjøres på dette tidspunktet.
- Legg musen med sin ventral side eksponert på et skjærebrett. Dekk magen med 70% etanol for å hindre hår forurenser abdominal innholdet under ekstrahering av tykktarmen.
- Bruk pinsett for å forstå midtlinjen av buken og gjøre et lite snitt for å eksponere peritoneum.
- Utvide denne innsnitt på hver side av bukhulen langs costal Margin.
- Bruke saks for å klippe gjennom bekkenet, slik at kolon kan høstes ned til anorektal veikryss. Dette er viktig fordi DSS kolitt skade er størst ved den distale rektum og tilsvarende, er dette området av størst tumor utvikling.
- Ytterligere vev som mesenteric lymfeknuter kan også høstes på dette tidspunktet.
5. Klargjøre Colon for Makroskopisk analyse
- Bruke en 18G gavage nål festet til en 5 ml sprøyte, skyll kolon med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) slik at fluid kommer ut i den fysiologiske retning. Hvis kolon vev vil bli brukt for RNA eller protein-basert analyse, kan det holdes kaldt ved anvendelse før kjølt arbeid skuffer.
- Åpne blussende kolon langsgående langs mesentery og maling på den kalde skuffen. Svulster er mer lett å visualisere når tykktarmen plasseres på en mørk overflate. Alternativt kan 1% Alcian blått fargestoff brukes til å markere tumors. Vurdere tumor antall og størrelse med en linjal eller digital caliper.
- Små deler av tumor og tilstøtende normalt vev kan bearbeides på dette punktet for fremtidig analyse av RNA, protein, eller immunhistokjemiske (IHC) metoder, slik at noen del av den gjenværende kolon for histologisk vurdering.
Digital fotografering av brutto kolon prøvene umiddelbart etter trinn 5.2 kan være nyttig for nøyaktig analyse av tumormasser, spesielt hvis vesentlige deler av kolon excised til andre former for analyse som beskrevet ovenfor. Tumormengde (%) kan beregnes som svulsten området / total kolon området ved hjelp av gratis programvare som ImageJ.
6. Klargjøre Colon for histologiske undersøkelser
- Påfør 10% formalin til gjenværende kolon på kaldt skuffen via sprøyte eller fingeren. Tillater vevet å fastsette for minst 30 sekunder i denne måten forenkler overføring til fiksering bassenget. Sikre gjenværende formalin er WIPed av før maling et nyåpnet kolon på samme magasin.
- Overfør kolon til et basseng fylt med 10% formalin og pin ned på kantene.
- Etter 3 timer av fiksering, overføre kolon til 70% etanol. Kolon kan bevares i 70% etanol på ubestemt tid.
- Tre langsgående deler av tykktarmen (proksimal, mid, distal / endetarm) kan stabiliseres i 2% agar og sendt inn for parafin innebygging. Sikre at proksimale colon og distale tykktarm / endetarm er orientert på en ensartet måte for hver mus.
- Dysplasi, krypten skade og betennelse kan beskrives og vurderes av en erfaren person ifølge tidligere publiserte protokoller. 10, kan 13-15 Mus ofres før dag 70 hvis eksperimentator er interessert i å oppdage tidlige dysplastiske hendelser.
7. Representant Resultater
Den AOM / DSS modellen beskrevet tillater forskeren å pålitelig generere tykktarmskreft hos mus.Tumorvekst i denne modellen er direkte påvirket av den tilknyttede inflammatorisk prosess. Kolitt alvorlighetsgrad bør overvåkes klinisk ved å følge vekttap og tilstedeværelse av diaré / Hematochezia (figur 2). Disse tegnene på sykdommen aktivitet har en tendens til å begynne med dagen fem av DSS syklus og for fire eller flere dager etter DSS er fjernet. Sjelden, kan mus med en betydelig rektal tumormasser utvikle rektal prolaps. Etter den andre eller tredje DSS syklus diaré kan være vedvarende. Vanligvis svulster er tilstede og identifiserbare ved murin koloskopi før tredje syklus av DSS (figur 3). Ytterligere tid og en tredje løpet av DSS resultater i større svulster på tidspunktet for innhøstingen (figur 4). Bruk av topikalt Alcian blå flekken kan brukes til å markere svulster (figur 5). Fotografier av colonic svulster vil bistå i generere tumor målinger som kan brukes til å sammenligne kvantitativt tumor produksjon og størrelsemellom eksperimentelle grupper (figur 6). Faste og parafin innebygde kolon prøver kan deretter evalueres for histologi eller med bruk av immunhistokjemisk farging (figur 7 og 8).
Figur 1. Skjematisk av AOM og DSS administrasjon. AOM (10 mg / kg) injiseres på dag 0. Ved begynnelsen av den andre uken (dag 7), er 2,5% DSS løsning administrert til mus i deres drikkevann. Syv dager DSS er etterfulgt av to uker med autoklaverte vann. Ytterligere to sykluser med DSS administreres før ofre.
Figur 2. Mouse vekt i forhold til baseline i løpet av AOM og DSS administrasjon. Merk at i uken etter hvert DSS syklus, mus los e 5-10% av kroppsvekten sin. Vekttap i dette eksperimentet er en surrogatmarkør for kolitt alvorlighetsgrad.
Figur 3. Visning av svulster i distale colon via murint endoskopi på dag 50 av AOM / DSS behandling. Obs de multiple Polypoid massene hinder lumen av distale colon (b, c) i forhold til den normale kolon (a).
Figur 4. Lengderetningen åpnet mus kolon illustrerer brutto utseende av tumorer. Merk tumormengde i den distale tykktarm / endetarm (venstre øvre bilde), og det karakteristiske rugated teksturen av proksimale kolon (høyre øvre bilde) med liten tumorvekst. En tett opp visning av den distale kolon viser mange svulster av varierende størrelse (under).
Figur 5. Svulster markerte ved anvendelse av Alcian blå flekken. Legg merke til hvordan fargestoff understreker normalen tekstur av tykktarmen samt grenser hver individuelle tumor. Slik farging kan være nyttig i nøyaktig måling av tumor områder med linjal eller digital måling.
Figur 6. Representativ fordeling av gjennomsnittlig antall svulster pr mus behandlet med AOM / DSS. Obs flertallet av svulster er plassert i den distale colon og er <2 mm i størrelse.
Figur 7. Parafin-embedded langsgående deler av tykktarmen i kassett (over) end slide etter H & E flekken (nedenfor). Vær oppmerksom på at gjenværende Alcian blå flekken ikke forstyrrer H & E flekker. En stor svulsten er innringet på lysbildet (innringet). Betegnelsene "distal", "middle" og "proximal" resultat fra seksjonering hele tykktarmen i tredjedeler mellom cecum og anus.
Figur 8. Representant histologi av en svulst som følge AOM / DSS administrering i den distale colon. H & E, BrdU, og β-catenin farget lysbilder på 50X (Topplate) og 400X (Nedre panel) henholdsvis demonstrere dysplastiske endringer ligner menneskelige adenocarcinomas av kolon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling av mus med AOM og DSS raskt og effektivt modeller humant kolitt-assosiert kreft. Hypoteser om arvelige faktorer som bidrar til kolitt-assosierte kreft kan lett studert med genmanipulerte mus. 13, 16 Alternativt kan effekten av farmakologisk mål i kolitt-assosiert kreft bli studert ved anvendelse villtype mus.
Selv om denne modellen er høyt verdsatt av de som er interessert i studiet av tykktarmen tumorutviklingen i innstillingen av betennelse, begrensninger eksisterer. Omfanget av sykdommen observert i mus i denne modellen kan variere betydelig avhengig av mus belastning og boforhold (caging, fôring, bakterieflora, etc.). Suzuki et. al rapporterte at Balb / c mus var mest følsomme for AOM / DSS, etterfulgt av (for synkende svulstforekomsten og mangfold) C57BL/6N, C3H/HeN, og DBA/2N mus. 17 Forsøk med DSS og AOM alene i 129 / sv mus ville forutsi en modusfrekvensrespons til kombinert behandling, lik C57/BL6J 18 mus, 19. Derfor kan pilot eksperimenter være nødvendig å finne de mest effektive dosering protokoller avhengig tilgjengelige fasiliteter og ressurser. Mens AOM / DSS svulster i tykktarmen ligner menneskelige kolorektal kreft histologisk, de sjelden viser metastasering. På et molekylært nivå, har endringer i β-catenin, COX-2, og iNOS, men ikke p53 blitt rapportert. 20 Kanneganti et. al. gir en grundig oversikt over alternative modeller for induksjon av CERT for de som er interessert. 5
Å øke reproduserbarheten av resultatene, anbefaler vi at mus av ulike genetiske bakgrunn (som WT og gen bestemt knock out mus) være co-bur i en bestemt patogen gratis (SPF) anlegg 3-4 uker før forsøket starter, dette er spesielt viktig hvis mus er nylig levert fra en kommersiell avl anlegget. Men enhver kjønn og alder-matchet mus kan brukes, we har observert de mest konsekvente resultater med alle hunnmus. AOM stamløsninger bør ikke brukes hvis eldre enn ett år, og det er viktig å unngå at flere fryse-tine sykluser av disse løsningene. Kolitt alvorlighetsgrad kan påvirkes av hvilken type mus fôr samt DSS kilde, disse faktorene bør holdes konsekvent mellom eksperimenter. Vi har observert turbiditet i DSS flasker igjen i mus bur i lange perioder (> 4 dager) kan tyde på forurensning, derfor kjøle-og forbereder ferske DSS ved starten av hver administrasjon vil unngå denne komplikasjonen. Hvis noen svulster utvikler eller mus dør for tidlig, Neufert et. al. i sin AOM / DSS protokollen oppsummering gir en utmerket tabell over feilsøking råd. 6
Når AOM / DSS teknikk for utvikling av kolitt-assosiert kreft beherskes, kan forskjellige tilleggsundersøkelser til disse musene utføres. 21 Ekspresjon av kandidatgener kan studeres i tumor vs tumor-free deler av tykktarmen via kvantitativ PCR forsterkning av utvunnet RNA. Fordi DSS selv kan forstyrre denne prosessen, anbefaler vi poly-A rensing før forsterkning. 22 Deler av tykktarmen kan være flash frosset å bli studert for protein uttrykk ved vestlige blot. Etterforskerne av kolitt-assosiert kreft kan være interessert i visuelle markører for celleproliferasjon. For dette formål, kan AOM / DSS behandlede mus bli injisert med bromodeoxyuridine (BrdU) 90 min før ofre, immunhistokjemi for disse merkede kjerner dokumentene vel områdene i tykktarmen med størst epiteliale spredning, både innenfor tumor og tumor-free seksjoner. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert delvis av DK089016 og L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), og P30-DK52574 (til Washington University Digestive Diseases Forskning Core). AIT var en Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
References
- Ekbom, A. Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).
- Terzic, J. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).
- Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H. Intestinal inflammation and cancer. Gastroenterology. 140, 1807-1816 (2011).
- Okayasu, I. Dysplasia and carcinoma development in a repeated dextran sulfate sodium-induced colitis model. J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 1078-1083 (2002).
- Kanneganti, M., Mino-Kenudson, M., Mizoguchi, E. Animal models of colitis-associated carcinogenesis. J. Biomed. Biotechnol. 342637, (2011).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat. Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Tanaka, T. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94, 965-973 (2003).
- De Robertis, M. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J. Carcinog. 10, 9 (2011).
- Wirtz, S. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
- Cooper, H. S. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69, 238-249 (1993).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat. Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Becker, C., Fantini, M. C., Wirtz, S., Nikolaev, A., Kiesslich, R., Lehr, H. A., Galle, P. R., Neurath, M. F. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Shaker, A. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. J. Clin. Invest. 120, 2081-2093 (2010).
- Boivin, G. P. Pathology of mouse models of intestinal cancer: consensus report and recommendations. Gastroenterology. 124, 762-777 (2003).
- Cooper, H. S. Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model. Relevance to colitis-associated neoplasia in the human: a study of histopathology, B-catenin and p53 expression and the role of inflammation. Carcinogenesis. 21, 757-768 (2000).
- Yoshida, Y. The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology. 132, 1420-1431 (2007).
- Suzuki, R. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27, 162-169 (2006).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Nambiar, P. R. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int. J. Oncol. 22, 145-150 (2003).
- Tanaka, T. Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies. J Carcinog. 8, (2009).
- Ciorba, M. A. Induction of IDO-1 by immunostimulatory DNA limits severity of experimental colitis. J. Immunol. 184, 3907-3916 (2010).
- Kerr, T. A. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: A poly-A purification solution. Inflamm. Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
- Tang, Y. is required for resection-induced changes in apoptosis, proliferation, and members of the extrinsic cell death pathways. Gastroenterology. 126, 220-230 (2004).
