Summary
We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.
Abstract
Cellulaire invasie in de lokale weefsels is een proces van belang in de ontwikkeling en homeostase. Malregulated invasie en daaropvolgende cel beweging is kenmerkend meerdere pathologische processen, waaronder ontsteking, cardiovasculaire ziekte en tumorcel metastase 1. Gefocaliseerd proteolytische afbraak van extracellulaire matrix (ECM) in de epitheliale of endotheliale basaalmembraan is een kritische stap in de inleiding cellulaire invasie. In tumorcellen is uitgebreid in vitro analyse vastgesteld dat ECM afbraak wordt bereikt door ventrale actine-rijke membraan protrusive structuren genoemd invadopodia 2,3. Invadopodia vorm in nauwe appositie de ECM, waar ECM afbraak matigen door de werking van matrix metalloproteinases (MMP's). Het vermogen van tumorcellen om invadopodia vormen correleert direct met de mogelijkheid om binnen te dringen in lokale stroma en geassocieerde vasculaire componenten 3.
_content "> Visualisatie van invadopodia-gemedieerde ECM afbraak van cellen door fluorescentiemicroscopie met kleurstof gemerkte eiwitten matrix aangebracht op dekglaasjes heeft zich ontwikkeld tot de meest voorkomende techniek voor het evalueren van de mate van proteolyse en cellulaire matrix invasieve potentieel 4,5. Hier beschrijven we een versie van de standaard werkwijze voor het fluorescentie-gemerkte dekglaasjes met behulp van een commercieel verkrijgbare Oregon Green-488 gelatine conjugaat. Deze methode is eenvoudig geschaald snel worden grote aantallen beklede dekglaasjes. We tonen enkele van de gemeenschappelijke microscopische artefacten die vaak optreden tijdens deze procedure en hoe deze kan worden vermeden. Tenslotte we gestandaardiseerde methoden met behulp van gemakkelijk verkrijgbare computersoftware voor kwantificering van gemerkt gelatine matrix afbraak gemedieerd door individuele cellen en gehele celpopulaties kunnen beschrijven. beschreven procedures de mogelijkheid bieden om nauwkeurig en reproduceerbaar te controleren invadopodiaactiviteit, en kan ook dienen als een platform voor het evalueren van de werkzaamheid van modulerende eiwitexpressie of testen van anti-invasieve verbindingen op extracellulaire matrix afbraak in enkele en meercellige instellingen.Protocol
1. Productie van Oregon Green 488-gelatine beklede dekglaasjes
- Bereid een ongelabelde 5% (w / w) stock gelatine / sucrose oplossing door toevoeging van 1,25 g gelatine en 1,25 g sucrose in PBS tot een eindvolume van 50 ml. Verwarm de stock gelatineoplossing tot 37 ° C en dat geschikt is volledig gesmolten voor gebruik. Bewaar het uiteindelijke mengsel bij 4 ° C.
- Reinigen 13 mm diameter # 1 dekglaasjes door het plaatsen van een individuele dekglaasje in elk putje van een 24 well plastic weefselkweekplaat. Voeg 500 ul van 20% salpeterzuur in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten. Zuig het salpeterzuur oplossing weg en was dekglaasjes drie keer met gedeïoniseerd water.
- Coat coverslips met 500 ul van 50 ug / ml poly-L-lysine (bereid uit 0,1% voorraadoplossing en verdund in gedeïoniseerd water) aan elk putje gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de oplossing en was driemaal met PBS. Poly-L-lysine coating vergemakkelijkt gelijkmatige laag en lijmen van de bovenliggende labeled gelatine.
- Voeg 500 ul van 0,5% glutaraldehyde (vers gemaakt voor gebruik) aan elk putje en incubeer de platen met 24 putjes op ijs gedurende 15 minuten. Zuig en was driemaal met koude PBS. Zorg ervoor dat u alle sporen van PBS te verwijderen voorafgaand aan de gelatine coating. Houd platen op ijs gedurende alle wasbeurten tot de gelatine wordt toegevoegd.
- Los het Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine als protocol per fabrikant en opwarmen en het ongelabelde 5% gelatine / sucrose oplossing van (1,1) tot 37 ° C. Verdun enerzijds Oregon Green 488 gelatine in acht delen ongelabelde gelatine / sucrose (ie; 500 pi Oregon Green 488 gelatine in 4 ml van 5% gelatine mengsel). Pipetteer 100 ul van de verdunde 488-gelatinemengsel (bij 37 ° C) op elke dekglaasje, met genoeg gelatine te bekleden het dekglaasje zonder handmatige strooien (wat kan leiden tot ongelijkmatige dekglaasje coating zie figuur 3B). Het is belangrijk om de verdunde 488-gelatinemengsel houden bij 37 °; C tijdens de bekledingsprocedure om voortijdige stolling te voorkomen. Uit deze stap de dekglaasjes worden bewaard in het donker zoveel mogelijk potentiële fotobleken voorkomen. Andere ECM eiwitten geconjugeerd aan verschillende fluoroforen kunnen vervangen Oregon Green 488 gelatine (zie discussie).
- Zodra alle coverslips zijn bedekt met een plaat, houdt de plaat met 24 putjes in een hoek en overtollig gelatine uit elk putje onder vacuüm aspiratie. Incubeer beklede dekglaasjes in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de coverslips driemaal met PBS en voeg 500 pi vers gemaakte 5 mg / ml natriumboorhydride (NaBH4) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te verminderen en inactiveren resterende glutaraldehyde. Natriumboorhydride is bruisend, en kleine belletjes zal duidelijk zijn op en rond elke dekglaasje aan.
- Verwijder de NaBH4 oplossing door afzuigen in vacuo met een snelle zwaaibeweging rond de buitenzijde van elk putje. Zorg ervoor dat u pick-up een drijvend dekglaasjes dat werd losgemaakt van de bodem van de weefselkweek plaat tijdens NaBH4 behandeling. Vrijstaande dekglaasjes die zweven naar de top kan terug voorzichtig worden ingedrukt naar de put bodem, maar zorg moet worden genomen om te voorkomen dat schade aan het eiwit coating. Was elk putje driemaal met PBS en incubeer dekglaasjes in 70% ethanol gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Met steriele techniek overdragen dekglaasje bevattende platen om een type IIA / B celkweek laminaire stroming kap en spoel coverslips driemaal met steriel PBS. Op dit punt dekglaasjes worden opgeslagen in PBS beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende ten minste twee maanden.
- Overdracht coverslips worden gebruikt voor afbraak assays een lege put van een nieuwe plaat met 24 putjes door zorgvuldig verwijderen met een steriele naald en forceps. Equilibreren dekglaasjes gedurende 1-24 uur met volledige media afgestemd op de specifieke celtype worden getest. Zorg moet worden genomen niethet dekglaasje inverteren of krassen op de gelatine coating (zie Figuur 3B).
2. Plating en verwerking van Cellen op Oregon Green 488-gelatine beklede dekglaasjes om Assay ECM afbraak
- Seed 3-5x10 4 cellen op een dekglaasje in elk putje van de plaat met 24 putjes.
- Voer een tijdsverloop studie naar optimale tijden die nodig zijn voor invadopodia degradatie activiteit voor de bepaalde cellijn / type van belang vast te stellen. Meeste invasieve cellen vereisen een tijd tussen 4-24 h voor degradatie gebleken, hoewel dit bereik kan sterk variëren en moet empirisch worden bepaald. Om invadopodia activiteit synchroniseren cellen worden behandeld met MMP remmers (bijv. GM 6001) voor een gewenste periode, dan was de inhibitor om invadopodia activiteit te gaan (zie bijvoorbeeld 6).
- Spoel coverslips driemaal met PBS, bevestig cellen met 500 ui 10% gebufferde formaline fosfate gedurende 15 minuten. Spoel driemaal met PBS en doorlaatbaar voor 4 min met 0,4% Triton X-100 in PBS. Spoel driemaal met PBS om de Triton X-100 te verwijderen.
- Label cellen met behulp van een standaard protocol voor immunofluorescentie kleuring (zie 7 bijvoorbeeld) door co-labeling cellen met fluorescent geconjugeerd phalloidin aan actine filamenten (F-actine) en visualiseren voor een bekende merkereiwit dat gelokaliseerd op invadopodia (eg; cortactin 5, TKS5 8 of N-wesp 9). Belangrijk is om met 488-gemerkte secundaire antilichamen of GFP-gemerkte eiwitten bij gebruik Oregon Green 488 of FITC-gemerkt gelatine om signaalinterferentie voorkomen.
- Monteer lood dekglaasjes op glas microscoopglaasjes door voorzichtig omkeren van de dekglaasje en het op een daling van ProLong Gold antifade of soortgelijke reagens.
- Om matrix degradatie, beeld-cellen te beoordelen in passende kanalen met behulp van een conventionele TL-of confocale microscoop. Gelatine degradatiewordt gevisualiseerd als donkere gebieden op het dekglaasje door proteolytische verwijdering van het fluorescente gelatine (Figuur 4A). Labeling van cellen voor actine en een invadopodia merkereiwit maakt bevestiging van invadopodia in gebieden van matrixafbraak in samengevoegde beelden (Figuur 4A).
- Degradatie activiteit kan ook worden gevolgd in real time door live cell imaging met fluorescentie-gelabelde recombinante eiwitten aan invadopodia vorming en matrix degradatie 5,10,11 volgen.
3. Kwantificering van TL Gelatine Degradatie door het meten van genormaliseerde Matrix Degradatie
Deze analyse geeft de genormaliseerde gebied van matrixafbraak opzichte van het oppervlak van de cellen of het aantal cellen. Het is nuttig voor het analyseren gehele microscopische gezichtsveld waar meerdere cellen aanwezig die gezamenlijk behandeld met siRNA, groeifactoren of therapeutische middelen. Hiervoor analysis, beelden verzameld bij lagere vergroting voldoende efficiënt verzamelen over populaties van cellen.
- Open de beelden in ImageJ 12. ImageJ voor microscopie kan worden gedownload van http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Controleer de schaal informatie door te kiezen voor de menu-commando "Analyseer / Set Scale." Deze informatie wordt automatisch geïmporteerd met vele bestandsformaten, maar kunnen handmatig worden ingevoerd, indien nodig. Een goede scaling is noodzakelijk om metingen rapporteren micron in plaats van pixels.
- Selecteer de juiste metingen op te sporen door te kiezen voor "Analyze / Set Afmetingen." Controleer gebied en Beperk tot Threshold.
- Bereken de oppervlakte van degradatie met behulp van de fluorescerende gelatine (Figuur 5A).
- Threshold het beeld ("Afbeelding / Aanpassen / drempel") naar de bovenste en onderste pi ingesteldxel intensiteitswaarden de gebieden van de afbraak (; Figuur 5B rood gekleurd) te selecteren. In de daaropvolgende beelden, gebruikt u de knop Instellen in het Threshold venster op dezelfde drempel voor alle beelden ingesteld als een objectieve manier om te selecteren degradatie zone.
- In sommige gevallen kan het dekglaasje niet volkomen vlak wanneer beelden worden verkregen. Dit zorgt ervoor dat de intensiteit van de gelatine te veranderen over het beeld. Als deze variant levert problemen bij drempelen de afbeelding juist voor ongelijkmatige belichting in de gelatine door het aftrekken van de achtergrond ("Process / aftrekken achtergrond") of door filtreren met een banddoorlaatfilter ("Process / FFT / banddoorlaatfilter") of een pseudo flatfield filter ("Proces / Filters / Pseudo Flatfield") tot de achtergrond intensiteit is uniform.
- Meet de oppervlakte van matrix afbraak ("Analyze / Analyseer Particles"). In het analyseren Deeltjes venster, kies een deeltjesgrootte> 0 om ruis te verwijderen van tHij selectie. Toon Outlines te identificeren regio's van belang (ROI). Controleer zien Laat de resultaten en samenvatten om metingen laten zien. Als de tekening heeft specifieke voorschriften geformuleerd alle gebieden van de afbraak (Figuur 5C), kopieert u de totale oppervlakte meting in een spreadsheet. Als andere materialen werden gekozen (zoals steenslag), registreert alleen de gebieden van de betreffende ROI.
- Bereken de cel gebied met behulp van de phalloidin gekleurd (F-actine) beeld (Figuur 5D).
- Threshold het beeld ("Afbeelding / Aanpassen / drempel") naar de bovenste en onderste pixel intensiteit waarden, zodat de randen van de cellen zijn geselecteerd (gemarkeerd in rood; Figuur 5E) in te stellen. In de daaropvolgende beelden, gebruikt u de knop Instellen in het Threshold venster op dezelfde drempel voor alle beelden ingesteld als een objectieve manier om te selecteren cel gebied.
- 10 Meet het oppervlak van de cellen ("Analyze / Analyseer Particles"). In de Analyze Partikelen venster, kies een deeltjesgrootte> 0 om ruis te verwijderen uit de selectie. Toon Outlines te identificeren regio's voor analyse (Figuur 5F). Controleer zien Laat de resultaten en samenvatten tot gebied metingen laten zien. Niet controleren opnemen gaten of er ruimten tussen cellen in een cluster dus de niet-geselecteerde pixels binnen de cluster niet opgenomen in het celgebied berekening. Kies OK.
- Kopieer de omgeving voor de relevante ROI in een spreadsheet.
- Bereken de oppervlakte van gelatine per oppervlakte afbraak van cellen 13.
- Een alternatieve benadering zou het gebied van afbraak aantal cellen per rapporteren van tel kernen (Figuur 5G). Dit is noodzakelijk als manipulaties veranderen de cel gebied tussen de verschillende vergeleken behandelingsgroepen. Automatisch tellen werkt het beste als kernen zijn goed gescheiden, uniform in intensiteit en rond. Automatisch tellen nuclei ("Plugins / Particle Analysis / Nucleus Teller"). Kies Kleinste en grootste deeltjesgrootte, een Threshold methode en een Smoothing methode. Controleer Trek Achtergrond, Watershed Filter, Voeg Deeltjes om de ROI Manager en Show Summary (figuur 5H).
- Als kernen elkaar overlappen uitgebreid of hebben een onregelmatige vorm of structuur, kan de automatische tellen niet tot een nauwkeurige telling (figuur 5H, pijlen op rechts). In dit geval kan handmatig tellen worden vergemakkelijkt met het celteller tool ("Plugins / Particle Analysis / Cell Counter"). Dit blijft gelden als cellen gemarkeerd tijdens een handmatige telling (figuur 5I).
- Kopieer aantal cellen (kernen) in een spreadsheet. Bereken de oppervlakte van gelatine afbraak per totaal aantal cellen.
4. Kwantificering van TL Gelatine Degradatie door individuele cellen in een Gemengde Cellular Bevolking Om matrix gevol-specifieke cellen in een populatie van andere cellen in het veld (bijvoorbeeld getransfecteerd versus niet-getransfecteerde cellen) te evalueren, kan de procedure in punt 3 worden aangepast aan het gebied van degradatie onder afzonderlijke cellen te meten. Een extra kanaal fluorescentie is nodig om getransfecteerde cellen te markeren. In dit geval wordt een sterkere vergroting beelden en goed gescheiden cellen gemakkelijker te kwantificeren.
- Controleer de schaal informatie door te kiezen voor de menu-commando "Analyseer / Set Scale." De juiste metingen op te sporen Selecteer door te kiezen voor "Analyze / Set Afmetingen." Controleer gebied en Beperk tot Threshold.
- Voor individuele cellen die niet raken, identificeren elke cel met de F-actine (Figuur 6A). Threshold het beeld (zie 3.9) (figuur 6B). Het is belangrijk om vastleggen van de randen van de cellen, maar er kunnen holes in dat niet in de drempel. Gebruik dezelfde intensiteit waarden in beelden naar cel grenzen te selecteren.
- Om de oppervlakte van de cellen te meten, gebruikt u "Analyze / Analyseer Deeltjes." In de Analyze Deeltjes venster, kies een maat> 0 (om ruis te verwijderen), Toon Outlines, en controleer zien Laat de resultaten, Toevoegen aan Manager en opnemen gaten (om op te nemen het hele gebied binnen de omtrek). Kies OK en noteer de omgeving voor elke cel van het venster Resultaten.
- Vaststellen welke cellen worden getransfecteerd (figuur 6C).
- Identificeer de gebieden van degradatie met behulp van de fluorescerende gelatine (Figuur 6D). Indien nodig, filtert de gelatine afbeelding om achtergrondintensiteit zelfs (zie 3.6). Drempel naar de gebieden van degradatie te selecteren, met vermelding van de drempel instellingen (figuur 6E). Op latere afbeeldingen, gebruik maken van deze zelfde bovenste en lagere intensiteit waarden (met behulp van de Setknop in het venster Threshold) voor een objectieve selectie van gebieden van afbraak.
- Meet de oppervlakten van afbreekt cellen. Op de thresholded fluorescerende gelatine beeld, tonen een overzicht van de cellen door het selecteren van ROI's in de ROI Manager venster en het selecteren van Measure (figuur 6F). Noteer de resultaten en bereken de genormaliseerde gebied van afbraak / cel of gebied.
5. Representatieve resultaten
De algemene schema van de procedure is weergegeven in figuur 1. De procedure omvat bereiding van dekglaasjes en bekleding met fluorescent-geconjugeerde gelatine, plating van cellen op de beklede dekglaasjes om cellen aan de gelatine afgebroken, fixeren en labelen van cellen voor fluorescentie microscopische analyse imaging de fluorescerende matrix de matrix integriteit beoordelen en objectief kwantificeren van de mate van gelatine matrix degradatie met behulp van computer software.
Figuur 1. Algemene schematische aandacht voor de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij fluorescerende gelatine coating, cel plating, vaststelling en immunokleuring, en evalueren van matrix proteolyse.
De belangrijkste procedurele stappen van het opstellen en coating dekglaasjes worden uiteengezet in figuur 2.
Figuur 2. Schematische het aantonen van de afzonderlijke stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van dekglaasjes voor gelatine matrix coating. Stappen gevoerd in het licht (brandt gloeilamp), op ijs (blokjes) en in het donker (niet-verlichte bol) zijn cartoon aangegeven. Stappen uitgevoerd in het donker helpen te voorkomen fotobleken van de fluorescerende matrices.
Wanneer goed uitgevoerd, zijn dekglaasjes gelijkmatig bedekt met Oregon Green 488-geconjugeerd gelatin, tonen homogene fluorescentie wanneer gevisualiseerd door microscopie (Figuur 3A). Typische artefacten die door onjuiste coating ontstaan, worden hantering, opslag en gebruik van gecoate dekglaasjes getoond in figuur 3B.
Figuur 3. Voorbeelden van artefacten die tijdens gelatine gecoate dekglaasje bereiding en verwerking. A. Orthogonale uitzicht op een confocale z-stack met de typische kleur en consistentie van een Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine gecoate dekglaasje geproduceerd met behulp van de voorgeschreven protocol. Dekglaasjes moet een homogene coating ~ 1-2 urn dik in de XZ (onder) en YZ (rechts) confocale vlakken B. kunstvoorwerpen die kunnen optreden tijdens de coating en verwerking van gelatine beklede dekglaasjes omvatten:. Onjuiste bekleding van de dekglaasje tijdens het coaten doorslechte menging versnellingsbak verspreiding of gedeeltelijke stolling van het gelatinemengsel (ongelijkmatige bekleding), verwijdering van het beklede matrix scoren met naalden of forceps tijdens behandeling (scrape), drogen van het dekglaasje oppervlak tijdens langdurige opslagperioden, resulterend in een "cobblestone "uiterlijk (uitgedroogd) en fotobleken van de fluorescerende gelatine oppervlak tijdens beeldvorming als gevolg van langdurige of hoge intensiteit blootstelling aan licht (bleken). Witte pijl geeft gebleekte gebied omvat een vergulde OSC19 hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom cel. De Oregon Green 488-geconjugeerd gelatine pseudocolored wit tot beeldcontrast verbeteren. Bar, 10 urn.
De resulterende dunne matrices die tijdens deze procedure een gevoelig middel om het vermogen van cellen om ECM degraderen evalueren. Figuur 4 toont een voorbeeld van invadopodia activiteit van een cel OSC19 uitgeplaat op een Oregon Green-488 geconjugeerd gelatine dekglaasjeen afgebeeld door gebruikelijke confocale microscopie en volume-fill beeldweergave na driedimensionaal deconvolutie.
Figuur 4. Representatieve voorbeelden van invadopodia matrixafbraak activiteit. A. Visualisatie van invadopodia en overeenkomstige gelatine matrix proteolyse. OSC19 cellen uitgeplaat op Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine dekglaasjes gedurende 10 uur gefixeerd en gelabeld met rhodamine-geconjugeerd phalloidin (F-actine) en anti-cortactin antilichamen (gevisualiseerd met Alexa Fluor 647 en secundair antilichaam pseudocolored groen). Invadopodia zijn duidelijk als centraal cytoplasmatische concentraties van F-actine en cortactin die overlappen met gebieden van gelatine clearing (donkere gaten in de matrix) in de samengevoegde afbeelding. Omkaderde gebieden met pijlpunten wijzen individuele invadopodia en gebieden van focale matrix proteolyse zoals in de uitgebreide reregio's hieronder. Bar, 10 urn. B. Volume vullen visualisatie van invadopodia penetratie in de ECM. OSC19 cellen geplateerd en gekleurd zoals in (A) werden visueel weergegeven door het verkrijgen van 23 opeenvolgende 0,32 urn optische z-segmenten totaal 7,04 urn voor rhodamine geconjugeerd phalloidin en Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine. De inheemse LSM bestand in te stellen voor elk kanaal werd geopend in AutoQuant X2.2-software en een 3D-blinde deconvolutie van elke afbeelding stapel werd uitgevoerd met behulp van de aanbevolen instellingen (10 iteraties, medium ruis). De bewerkte beelden werden opgeslagen als TIFF-stacks die vervolgens werden geopend in NIS Elements en weergegeven als een volume uitzicht met alpha blending. De LUT's werden aangepast, en een subvolume werd opgericht om een rand tonen in de cel waar invadopodia aanwezig zijn. Dorsale zijde view toont invadopodia (rood, pijlen) ingebracht in de onderliggende gelatine (groen). Ventrale-edge toont protrusive invadopodia en gebieden van gelatine degradatie onder de dekglaasjeals rode gebieden in de groene matrix (pijlpunten). De totale gepresenteerde beeldveld wordt bijgesneden tot 77 x 65 micrometer; de cel is ~ 60 x 40 micrometer.
Figuur 5 een aantal belangrijke stappen voor kwantificering van genormaliseerde gelatine matrixdegradatie beschreven in stap 3 van het protocol. Deze procedure is bedoeld om voor onpartijdige kwantificering van gelatine afbraak in een volledig gezichtsveld, en is geschikt voor matrixafbraak toegeschreven aan vele cellen in het veld.
Figuur 5. Schermopname beelden tonen de belangrijkste stappen in de computationele-het kwantificeren van genormaliseerde gelatine degradatie voor cellen in een hele microscopisch beeld, zoals beschreven in het protocol stap 3. Alle TL-beelden zijn omgezet in grijswaarden om beter weer te geven op de rode drempelwaarde en de ROI markeringen. A. Imleeftijd van Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine, met donkere gebieden ("gaten") waar degradatie heeft plaatsgevonden (stap 3.4). B. Thresholded gelatine beeld te markeren gebieden van degradatie in het rood (stap 3.5). C. Tekening met aanduiding van ROI gemeten voor gebied van de afbraak (stap 3.7). D. Rhodamine phalloidin kleuring van F-actine (stap 3.8). E. Thresholded actine beeld te markeren totale cel gebied in het rood (stap 3.9). F. Tekening met aanduiding van cel gebieden te meten (stap 3.10) . G. Afbeelding van DAPI gekleurde celkernen (stap 3.13). H. Rode lijnen geven de resultaten van de automatische kernen tellen (stap 3.13). De Watershed filter heeft de potentie om afzonderlijke kernen die elkaar raken (witte pijl). Als kernen overlappen uitgebreid, kunnen zij niet worden gescheiden in afzonderlijke objecten (rode pijl). Als een kern heeft een onregelmatige vorm kan worden verdeeld in meerdere objecten (gele pijl). I. </ Strong> Resultaten van het markeren kernen tijdens een handmatige telling met behulp van de cel teller gereedschap (stap 3.14).
Figuur 6. toont select stappen die betrokken zijn bij het kwantificeren van fluorescerende gelatine afbraak door afzonderlijke cellen in een gemengde cellulaire bevolking, zoals beschreven in het protocol stap 4. Hier kunnen matrix afbraak door getransfecteerde cellen worden geanalyseerd in een gemengde populatie van getransfecteerde en niet-getransfecteerde cellen.
Figuur 6. Scherm beelden vastleggen van de stappen die betrokken zijn bij het kwantificeren van gelatine degradatie van individuele getransfecteerde cellen binnen een cel populatie. Kwantificering van een getransfecteerde cel OSC19 overexpressie recombinant cortactin gefuseerd aan de FLAG epitoop tag wordt als voorbeeld getoond. Alle TL-beelden zijn omgezet in grijswaarden om beter weer te geven op de rode drempelwaarde en gele ROI markeringen. A. B. Tekening van totale cel ruimte die is gebaseerd op de F-actine vlekken na het aanbrengen van de drempel en analyseren Deeltjes functies (stap 4.2 tot 3). C. Confocale beeld van anti-FLAG immunokleuring van de celpopulatie waaruit een cel die FLAG-tag cortactin (aangegeven met *) (stap 4.4). D. Afbeelding van Oregon Green 488-geconjugeerde gelatine, met donkere gebieden ("gaten") waarbij de afbraak plaatsgevonden (stap 4.5) E. Thresholded gelatine beeld te markeren donkere gebieden van de afbraak in het rood (stap 4.5). F. Thresholded gelatine beeld bedekt met cel contouren van paneel B (stap 4.6). Merk op dat alleen de thresholded pixels in de cel lijnen worden meegeteld in de analyse. Gebieden van degradatie buiten de huidige cel locatie (witte pijl) het gevolg zijn van cel migratie over de gelatine in de tijd en zijn niet included in de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mogelijkheid om cellen verslechtering van de extracellulaire matrix te visualiseren heeft bijgedragen tot het ontdekken van de moleculaire mechanismen die werkzaam zijn in de vroege stappen van celinvasie. Ontwikkeld door Wen-Tien Chen in de vroege jaren 1980 4,14,15, heeft coating fluorescent gelabelde extracellulaire eiwitten op dekglaasjes voor daaropvolgende microscopische analyse bleek de primaire techniek evaluatie invadopodia functie in een breed bereik aan celtypen. Het voorgeschreven toont de basismethode voor het bereiden gelatine gecoate dekglaasjes met een collagene laag minder dan 2 urn dik geschikt voor detectie van extracellulaire matrix afbraak door cellen in de meeste conventionele fluorescente confocale microscopen en 11,16-18 vormen, vergelijkbaar met hetgeen eerder beschreven 19-21. Deze eigenschappen zorgen voor een snelle productie van beklede dekglaasjes in staat om de initiële aanvang van matrixafbraak. De gevoeligheid geboden door the resulterende dunne gelatine matrix op de onderliggende harde glasoppervlak waarschijnlijk steun in bevordering invadopodia vorming als reactie op het hoge inherente stijfheid van de totale matrix milieu 22. Echter, deze matrices niet geschikt voor analyse van invadopodia rek of andere morfologische evaluatie die is bereikt met dikkere (30-100 um) gelatinelagen met vergelijkbare methode, bekleed transwells of elektronenmicroscopie 20,23,24.
We hebben gevonden dat pre-geconjugeerd commercieel geproduceerd Oregon Green 488 gelatine zorgt voor een snelle experimentele en consistent reproduceerbare resultaten. Echter alkaline boraat conjugation of fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) op ongelabeld gelatine is een populaire en goedkope werkwijze voor het produceren fluorescent gelatine conjugaten 20. Fibronectine wordt ook gebruikt als alternatief matrix eiwit voor labeling en het dekglaasje coating 4,9, en in sommige gevallen investigators gebruikt gemerkte fibronectine gelaagd op unlabeled gelatine beklede dekglaasjes maken dichter matrices 11,25. Andere matrices kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het celtype. Naast kleurstoffen in het groene spectrum 488 nm hebben diverse fluoroforen ook gebruikt bij handmatige koppeling methoden dekglaasjes met verschillende fluorescentie spectra, zoals rhodamine 21,26, Alexa Fluor 350 24 546 21 568 5,11 genereren , 594 27 en 647 5 kleurstoffen. Dergelijke conjugaten zijn gemakkelijk aanpasbaar voor gebruik in de voorgeschreven protocol biedt voldoende flexibiliteit voor het gebruik van specifieke ECM eiwit-dye combinaties geschikt voor praktisch alle imaging filterset.
De hierin beschreven technieken de nodige gedetailleerde stappen voor het gebruik ImageJ gelatine matrixafbraak toegeschreven aan afzonderlijke cellen kwantificeren in een heterogene populatie of volledige cel groepen prev gepubliceerdiously 6,28. Eigen software is ook met succes toegepast voor hetzelfde doel 5,25. In dit protocol wordt het gebied van matrixafbraak genormaliseerd tot de totale oppervlakte van de cellen of het totale aantal cellen (kernen) in het veld. Algemeen zullen beide opties voor normalisatie hetzelfde resultaat geven (ELW, gegevens niet getoond). Echter verschillende cellijnen met verschillende afmetingen cellen worden vergeleken of de experimentele behandeling zorgt ervoor dat cellen grootte veranderen, dan kan nauwkeuriger te normaliseren aantal cellen. Anderzijds veel kankercellijnen een hoog percentage multi-kernhoudende cellen, waarbij totale celgebied een nauwkeuriger parameter voor normalisatie zijn. Ook slechts een deel van een cel gevangen in een afbeelding (figuur 6), kan het beter zijn om normaliseren celoppervlakte plaats van de afbraak potentieel voor een individuele cel onderschatten. Het is belangrijk om de beeldanalyse te optimaliseren voor een optimale afstemmingde kenmerken en nuances van de specifieke experimentele opstelling.
Voor het bepalen celaantallen in een overvolle veld tellen kernen vaak de voorkeursmethode. ImageJ heeft een kern teller plugin voor automatische tellen. Een optie in deze tool is het Watershed filter. Dit filter zal helpen afzonderlijke kernen die elkaar raken door een scheiding ze in afzonderlijke objecten (figuur 5H, witte pijl). Dit kan echter niet filter kunnen afzonderlijke kernen die uitgebreid overlappen (figuur 5H, rode pijl). Bovendien, als een kern heeft een onregelmatige vorm en grote variaties in intensiteit, kan het filter een kern gescheiden in meerdere objecten (figuur 5H gele pijl). Daarom is het belangrijk om verschillende drempelwaarden en afvlakmethoden in deze plugin proberen de beste parameters bepalen voor analyse. Als de automatische tellen produceert geen accurate cijfers, de cel teller plugin kan faci litate handmatige telling van cellen of kernen.
In gevallen gebruik transiënte transfectie worden beelden bevatten vaak een mengsel van cellen die of een eiwit van belang (Figuur 6). In dit scenario is het niet altijd duidelijk welke cellen verantwoordelijk voor het creëren gebieden van matrixafbraak. Dit is vooral het geval als de cellen migreren over de gelatine. Consistent zijn in de analyse is het belangrijk om alleen meten aangetaste gebieden direct onder elke cel. Drempeling van de donkere gebieden te selecteren in de matrix en met de actine naar cel lijnen genereren alleen de aangetaste gebieden in de cellen worden gekwantificeerd. Deze procedure zal uitsluiten aangetaste gebieden buiten celgrenzen van analyse (Figuur 6F, pijl). De test kan verlangen optimalisatie om een tijdstip dat er voldoende tijd laat voor de afbraak voordat de cellen een kans hebben gehad om te verhuizen te selecteren.
"> Talrijke werkwijzen zijn ontwikkeld om invadopodia vorming en functie kwantificeren. Naast matrixafbraak, andere voorkomende parameters bepalen omvatten van het aantal invadopodia per cel, het percentage cellen die invadopodia in een bepaalde populatie, en het aantal" onrijp "of" pre "niet-afbrekende invadopodia vergeleken met" oudere "invadopodia kunnen afbreken de ECM 11,13,25,26. Werkwijze (s) naar keuze voor invadopodia evaluatie afhankelijk inherente eigenschappen van elk celtype. bijvoorbeeld tellen van het aantal invadopodia per cel of het bepalen van het percentage cellen die invadopodia een rechtstreekse aanpak die goed werkt indien het geanalyseerde cellen bevatten enkele prominent invadopodia, maar moeilijker in cellen die tientallen invadopodia of waar invadopodia kan klein zijn en moeilijk te detecteren. gebruiken degradatie assay maakt het mogelijk om het percentage berekend van pre-invadopodia vs. mature invadopodia in enkele cellen of een populatie door de totale aantal cellen met invadopodia het percentage die afbrekende matrix. Als er een discrepantie waar minder cellen afbrekende matrix zijn vergeleken met cellen die invadopodia, duidt dat deze cellen pre-invadopodia die in staat matrixafbraak waren toen de cellen gefixeerd vormen.Welke methode combinatie gekozen voor de analyse, is het belangrijk om de gewenste eigenschappen invadopodia kwantificeren objectief mogelijk. Bij het verzamelen beelden op de microscoop, kiest velden door naar cellen (actine) en niet de fluorescerende matrix, om vertekening te voorkomen van voorkeur selectie van gebieden met hoge afbraak. Meerdere beelden moeten worden verworven om een eerlijke vertegenwoordiging van de celpopulatie te garanderen. Afbeeldingen mogen ook worden verkregen bij een geschikte vergroting. Voor homogene populaties van cellen, lagere vergroting kangebruikt worden om meer cellen te verzamelen, zolang het gebied van afbraak kan nog worden opgelost. Hogere vergroting beelden hebben de voorkeur om gebieden te meten op basis van individuele cellen en aan de individuele invadopodia op te lossen. Wanneer gebieden worden gekwantificeerd, drempelwaarden beelden gebaseerd op de intensiteit objectiever dan handmatig kiezen van de oppervlakte van de matrix te meten. In alle gevallen moet een voldoende aantal cellen van meerdere onafhankelijke experimenten worden geanalyseerd om statistisch betekenisvolle, reproduceerbare resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen uit schenkingen van de Universiteit van West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Wij danken Susette Mueller (Georgetown University) en Laura Kelley voor vroege advies en bijstand. Het gebruik van de Universiteit van West Virginia Microscopie Imaging Facility (ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en, NIH subsidies P20 RR16440, P30 en P30 RR032138 GM103488) wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
