Kvantitativ måling av Invadopodia-mediert Extracellular Matrix proteolyse i enkeltrom og Flercellede Contexts
Summary
Vi beskriver den prototypiske fremgangsmåte for fremstilling mikroskop dekkglass belagt med fluorescerende gelatin for å visualisere invadopodia-mediert matrise nedbrytning. Beregningsorientert teknikker ved hjelp av tilgjengelig programvare presenteres for å tallfeste resulterende nivåer av matrix proteolyse av enkeltceller i en blandet befolkning og for flercellede grupper som omfatter hele mikroskopiske felt.
Abstract
Cellular invasjonen i lokale vev er en prosess viktig i utvikling og homeostase. Malregulated invasjon og påfølgende cellebevegelse er karakteristisk for flere patologiske prosesser, inkludert betennelse, kardiovaskulær sykdom og tumorcelle metastasering 1. Focalized proteolytisk nedbrytning av ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i epiteliale eller endothelial basalmembran er et viktig skritt i å initiere cellulær invasjon. I kreftceller, har omfattende in vitro-analyse fastslått at ECM degradering oppnås ved ventrale aktin-rike membran protrusive strukturer betegnet invadopodia 2,3. Invadopodia skjema i nært apposisjon til ECM, hvor de modererer ECM sammenbrudd gjennom handling av matriksmetalloproteinaser (MMP). Muligheten av tumorceller til å danne invadopodia korrelerer direkte med evnen til å invadere i lokal stroma og tilhørende vaskulære komponenter 3.
_content "> Visualisering av invadopodia-mediert ECM nedbrytning av celler ved fluorescerende mikroskopi bruker dye-merket matriksproteiner belagt på glass dekkglass har dukket opp som den mest utbredte teknikken for å vurdere graden av matrix proteolyse og cellulære invasiv potensial 4,5. Her beskriver vi en versjon av standard metode for generering fluorescently-merket glass dekkglass utnytte en kommersielt tilgjengelig Oregon Grønn-488 gelatin konjugat. Denne metoden er enkelt skaleres raskt produsere store mengder belagte dekkglass. Vi viser noen av de vanligste mikroskopiske gjenstander som ofte oppstår løpet av denne prosedyren, og hvordan disse kan unngås. Endelig beskriver vi standardiserte metoder ved bruk av lett tilgjengelig datamaskin programvare for å tillate kvantifisering av merket gelatin matrise nedbrytning mediert av individuelle celler og ved hele cellulære populasjoner. De beskrevne prosedyrer gir evnen til å nøyaktig og reproduserbart overvåke invadopodiaaktivitet, og kan også tjene som en plattform for å evaluere effekten av modulerende protein ekspresjon eller testing av anti-invasive forbindelser på ekstracellulær matriks nedbrytning i enkelt-og flercellede innstillinger.Protocol
Discussion
Evnen til å visualisere celler nedverdigende den ekstracellulære matrix har hjulpet i å oppdage de molekylære mekanismene ansatt i de tidlige trinnene av celle invasjon. Utviklet av Wen-Tien Chen i tidlige 1980-tallet 4,14,15, har belegg fluorescensmerkede ekstracellulære proteiner på glass dekkglass for påfølgende mikroskopisk analyse dukket opp som den primære teknikk i å vurdere invadopodia funksjon over et bredt spekter av celletyper. Den foreskrevne protokollen demonstrerer grunnleggende metode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av legat midler fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi takker Susette Mueller (Georgetown University) og Laura Kelley for tidlig råd og hjelp. Bruken av West Virginia University Mikroskopi Imaging Facility (støttet av Mary Babb Randolph Cancer Center og NIH tilskudd P20 RR16440, P30 RR032138 og P30 GM103488) er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
