Summary
Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.
Abstract
Invasão celular em tecidos locais é um processo importante no desenvolvimento e homeostase. Invasão Malregulated e movimento subsequente é característica de células de vários processos patológicos, incluindo a inflamação, doença cardiovascular e metástases de células do tumor 1. Degradação proteolítica focalizado de matriz extracelular (ECM) em componentes da membrana basal epitelial e endotelial, é um passo crítico na iniciação invasão celular. Em células tumorais, extensa análise in vitro determinou que a degradação de ECM é realizado por ventrais estruturas ricas em actina de membrana denominado protrusivos invadopodia 2,3. Invadopodia forma em aposição próxima da ECM, onde moderada avaria ECM através da acção de metaloproteinases de matriz (MMPs). A capacidade das células tumorais para formar invadopodia correlaciona-se directamente com a capacidade de invadir a estroma local e associados componentes vasculares 3.
_content "> A visualização das invadopodia degradação mediada por ECM de células por microscopia de fluorescência usando proteínas marcadas com corante de matriz revestida em vidro lamelas tem emergido como a técnica mais comum para avaliar o grau de proteólise da matriz e do potencial invasivo celular 4,5. Aqui descrevemos uma versão do método padrão para a geração de lamelas de vidro marcados por fluorescência utilizando um equipamento comercialmente disponível Oregon Green-488 conjugado gelatina. Este método pode ser facilmente dimensionada para produzir rapidamente um grande número de lamelas revestidas. Mostramos alguns dos erros comuns microscópicas que são frequentemente encontrados durante este processo, e como estes podem ser evitados. Finalmente, descrevemos métodos normalizados, utilizando software de computador facilmente disponível para permitir a quantificação da degradação da matriz de gelatina marcada mediada por células individuais e por toda a populações celulares. Os procedimentos descritos proporcionam a capacidade de controlar de forma precisa e reprodutível invadopodiaactividade, e pode também servir como uma plataforma para a avaliação da eficácia da expressão da proteína de modulação ou ensaio de anti-invasivos compostos sobre a degradação da matriz extracelular em locais individuais e multicelulares.Protocol
1. Produção de Oregon Verde 488-Lamelas revestidas de gelatina
- Prepara-se uma 5% não marcado (w / w) estoque gelatina / solução de sacarose através da adição de 1,25 g de gelatina e 1,25 g de sacarose em PBS a um volume final de 50 ml. Aquecer a solução de gelatina a 37 ° C e garantir que ele é totalmente fundido antes da utilização. Armazenar a mistura final, a 4 ° C.
- Limpar diâmetro de 13 mm # 1 em lamelas de vidro de colocar uma lamela individual em cada poço de uma placa de cultura de tecido de plástico de 24 poços. Adicionar 500 ul de 20% de ácido nítrico a cada poço e incubar durante 30 min. Aspirar a solução de ácido nítrico e lavar lamelas três vezes com água desionizada.
- Lamelas revestimento com 500 ul de 50 ug / ml de poli-L-lisina (preparada a partir de 0,1%, solução de estoque e diluída em água desionizada) a cada poço durante 20 minutos à temperatura ambiente. Aspirar a solução e lavar três vezes com PBS. Poli-L-lisina de revestimento facilita ainda de revestimento e ligação do sobrejacente laBeled gelatina.
- Adicionar 500 ul de glutaraldeido a 0,5% (feito fresco antes da utilização) a cada poço e incuba-se as placas de 24 poços em gelo durante 15 min. Aspirar e lavar três vezes com PBS frio. Certifique-se de remover todos os vestígios de PBS antes do revestimento de gelatina. Manter as placas em gelo durante todas as lavagens até que a gelatina é adicionada.
- Reconstituir o verde Oregon 488-conjugados de gelatina como o protocolo do fabricante e, por isso e aquecer a unlabeled 5% solução de sacarose / gelatina a partir de (1.1) a 37 ° C. Diluir uma parte verde Oregon 488 gelatina em oito partes de sacarose não marcada / gelatina (isto é, 500 ul de Oregon 488 Verde gelatina em 4 mL de mistura de 5% de gelatina). Pipetar 100 ul da mistura 488-gelatina diluída (mantida a 37 ° C) em cada lamela, utilizando gelatina suficiente para revestir a lamela sem manual espalhamento (o que pode levar a lamela de revestimento desigual, como mostrado na Figura 3B). É importante manter a mistura em 488-gelatina diluída a 37 °; C durante o processo de revestimento, para evitar a solidificação prematura. A partir deste passo em frente as lamelas devem ser mantidos no escuro, tanto quanto possível para evitar a fotodegradação potencial. Outras proteínas da MEC conjugados com fluoróforos diferentes podem ser substituídos por Oregon Verde 488 de gelatina (ver discussão).
- Uma vez que todas as lamelas são revestidos de uma única placa, segure a placa de 24 poços em um ângulo e remover o excesso de gelatina a partir de cada poço por aspiração a vácuo. Incubar lamelas revestidas, no escuro durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavar as lamelas três vezes com PBS, em seguida, adicionar 500 ul de frescos borohidreto de sódio a 5 mg / ml (NaBH 4), durante 15 min à temperatura ambiente para reduzir e inactivar glutaraldeído residual. Boro-hidreto de sódio é efervescente, e pequenas bolhas serão evidentes e em torno de cada lamela.
- Remover a solução de NaBH 4 por aspiração a vácuo com um movimento rápido de varredura em torno do exterior de cada poço. Tomar cuidado para não se pegar qualquer lamelas flutuantes que se tornaram separado da parte inferior da placa de cultura de tecidos durante o tratamento NaBH 4. Lamínulas desconectadas que flutuam ao topo pode ser empurrou de volta para o fundo bem, mas é preciso ter cuidado para não danificar a camada de proteína. Lavar cada poço três vezes com PBS e depois incubadas em lamelas de etanol a 70% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Utilizando uma técnica estéril, transferir as placas contendo lamela a um IIA / B capuz célula de fluxo laminar do tipo de cultura e lavar lamelas três vezes com PBS estéril. Neste ponto lamelas podem ser armazenados em PBS ao abrigo da luz a 4 ° C durante pelo menos dois meses.
- Transferir lamelas a ser utilizado para ensaios de degradação de um poço vazio de uma placa de 24 novo poço por remoção cuidadosa utilizando uma agulha estéril e de uma pinça. Equilibrar as lamelas durante 1-24 horas com meios completos adequados para o tipo específico de célula a ser ensaiada. Cuidados devem ser tomados nãopara inverter a lamela ou riscar o revestimento de gelatina (ver Figura 3B).
2. Chapeamento e Processamento de Células no Oregon Verde 488-Lamelas gelatina revestidos para ensaio de degradação ECM
- Semente 3-5x10 4 células para uma lamela de cada poço da placa de 24 poços.
- Realizar um estudo de decurso de tempo para determinar os tempos óptimos necessários para invadopodia actividade de degradação para a linha de células particular / tipo de interesse. A maioria das células invasivas requerem um tempo entre 4-24 h para a degradação a tornar-se evidente, embora este intervalo possa variar largamente e deve ser determinada empiricamente. Para sincronizar invadopodia actividade, as células podem ser tratadas com inibidores de MMP (por exemplo, GM 6001), por um período de tempo desejado e, em seguida lavar o inibidor para permitir que a actividade invadopodia para prosseguir (por exemplo, ver 6).
- Enxaguar lamelas três vezes com PBS e, em seguida fixar as células com 500 ul de 10% de formalina tamponada fosfate durante 15 minutos. Enxaguar três vezes com PBS e permeabilizar durante 4 min com Triton 0,4% X-100 em PBS. Enxaguar três vezes com PBS para remover o Triton X-100.
- Células de etiquetas usando qualquer protocolo padrão para a coloração de imunofluorescência (ver, por exemplo, 7) por co-rotulagem células com faloidina fluorescente conjugada para visualizar os filamentos de actina (actina F) e para uma proteína marcador conhecido que localiza a invadopodia (eg; cortactina 5, TKS5 8, N ou vespa-9). Lembrar evitar o uso de 488 marcadas com anticorpos secundários marcados com GFP ou proteínas se utilizando verde de Oregon 488 ou marcado com FITC gelatina para evitar a interferência de sinal.
- Monte lamínulas coradas em lâminas de vidro de microscópio com cuidado invertendo lamela o e colocando-o em uma gota de prolongar Antifade Ouro ou reagente semelhante.
- Para avaliar a degradação da matriz, as células de imagem nos canais apropriados, usando um microscópio fluorescente convencional ou confocal. Degradação de gelatinaé visualizada como áreas mais escuras no lamela devido à remoção proteolítica de gelatina fluorescente (Figura 4A). Marcação das células para a actina e uma proteína marcadora invadopodia permite a confirmação da invadopodia em locais de degradação da matriz de imagens fundidas (Figura 4A).
- A atividade de degradação também pode ser monitorado em tempo real por imagens de células vivas com fluorescente etiquetados proteínas recombinantes para acompanhar invadopodia formação e degradação da matriz 5,10,11.
3. A quantificação da degradação de gelatina fluorescente por medição degradação da matriz normalizada
Esta análise proporciona a área normalizada de degradação da matriz em relação à área das células ou o número de células. É útil para a análise de toda a campos microscópicos de vista onde várias células estão presentes que foram tratados em conjunto com factores de crescimento, siRNA ou agentes terapêuticos. Para este Analysis, imagens recolhidas em baixa ampliação são suficientes para coletar eficientemente informações sobre populações de células.
- Abra as imagens em ImageJ 12. ImageJ para microscopia pode ser baixado do http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ .
- Verifique a informação de escala, escolhendo o comando de menu "Analisar / definir a escala." Esta informação irá importar automaticamente com muitos formatos de arquivo, mas pode ser feita manualmente, se necessário. Dimensionamento adequado é necessário denunciar as medidas em microns ao invés de pixels.
- Selecione as medidas apropriadas para acompanhar escolhendo "Analisar / definir medidas." Verificar área e Limite de Limiar.
- Calcula-se a área de degradação usando a imagem fluorescente de gelatina (Figura 5A).
- Limiar da imagem ("Image / Ajustar / Threshold") para definir o pi superior e inferiorvalores de intensidade xel para selecionar as áreas de degradação (destacado em vermelho; Figura 5B). Nas imagens seguintes, use o botão Configurar na janela Limiar para definir o limite de igual para todas as imagens como um meio objetivo para selecionar a área de degradação.
- Em alguns casos, a lamela pode não ser perfeitamente plana, quando as imagens são adquiridas. Isto faz com que a intensidade da gelatina para mudar entre a imagem. Se esta variação cria problemas quando limiarização da imagem, correto para a iluminação desigual entre a gelatina, subtraindo o fundo ("Processo / Subtrair Fundo") ou por filtragem com um filtro de banda ("Processo / FFT / Bandpass filtro") ou uma pseudo flatfield filtro ("Processo / Filtros / Flatfield Pseudo") até que a intensidade de fundo é uniforme.
- Medir a área de degradação da matriz ("Analisar / analisar partículas"). Na janela de Partículas Análise, escolha um tamanho de partícula> 0 para eliminar o ruído de tele selecção. Mostrar Esboços para identificar regiões de interesse (ROI). Verificar resultados de exibição e Resumir para mostrar medições. Se o desenho tenha descrito especificamente todas as áreas de degradação (Figura 5C), copiar a medição da área total numa folha de cálculo. Se outros objetos foram selecionados (como restos), gravar apenas as áreas do ROIs relevante.
- Calcula-se a área da célula corada utilizando a faloidina (F-actina) imagem (Figura 5D).
- Limiar da imagem ("Image / Ajuste Limiar /") para ajustar os valores de pixel de intensidade superior e inferior de modo que as arestas das células foram seleccionados (realçado em vermelho; 5E Figura). Nas imagens seguintes, use o botão Configurar na janela Limiar para definir o limite de igual para todas as imagens como um meio objetivo de selecionar área da célula.
- 10 Medida da área das células ("Analisar / Analise Particles"). No Parti Analiseculos janela, escolha um tamanho de partícula> 0 para eliminar o ruído da seleção. Mostrar Outlines para identificar regiões para análise (Figura 5F). Verificar resultados de exibição e Resumir para mostrar a medição da área. Não verificar incluem furos se existem espaços entre as células de um cluster de modo que os pixels não seleccionados dentro do grupo não serão incluídas no cálculo da área da célula. Clique em OK.
- Copie os resultados da área de ROIs relevantes em uma planilha.
- Calcula-se a área de degradação de gelatina por área total de 13 células.
- Uma abordagem alternativa seria a de denunciar a área de degradação por número de células de contagem dos núcleos (Figura 5G). Isto é necessário se manipulações alterar a área da célula entre os diferentes grupos de tratamento comparados. Contagem automática funciona melhor se os núcleos são bem separados, uniforme em intensidade e redondo. Contar automaticamente nuclei ("Plugins / partícula Análise / Contador Núcleo"). Escolha tamanho de partícula menor e maior, de um método de limiar e um método de alisamento. Verifique Subtrair filtro de fundo, Watershed, adicionar partículas de ROI Manager e Resumo Show (Figura 5H).
- Se núcleos sobrepõem extensivamente ou têm uma forma irregular ou textura, a contagem automática pode não produzir uma contagem exata (Figura 5H, setas direita). Neste caso, a contagem manual pode ser facilitada utilizando a ferramenta de contador de células ("Plugins / Análise de Partículas / Counter Cell"). Isto irá manter a contagem as células são marcadas durante uma contagem manual (figura 5I).
- Copiar o número de células (núcleos) numa folha de cálculo. Calcula-se a área de degradação de gelatina por número total de células.
4. Quantificação da Degradação Fluorescente gelatina por células individuais em uma população mista Celular Para avaliar a degradação da matriz resultante a partir de células específicas de uma população para além de outras células no campo (por exemplo, transfectadas versus não-transfectadas células), o procedimento na secção 3 pode ser modificado para medir a área de degradação sob as células individuais. Um canal adicional fluorescente é necessária para marcar células transfectadas. Neste caso, imagens de alta ampliação e bem separadas as células são mais fáceis de quantificar.
- Verifique a informação de escala, escolhendo o comando de menu "Analisar / definir a escala". Selecione as medidas apropriadas para acompanhar escolhendo "Analisar / definir medidas." Verificar área e Limite de Limiar.
- Para células individuais, que não se tocam, identificar cada célula usando a imagem F-actina (Figura 6A). Limiar da imagem (ver 3.9) (Figura 6B). É importante para capturar as extremidades das células, mas não pode haver buracos no interior que não estão incluídas no limiar. Use os valores de intensidade mesmo em imagens para selecionar limites da célula.
- Para medir a área das células, use "Analisar / analisar partículas." Na janela de Partículas Análise, escolha um tamanho> 0 (para eliminar o ruído) Outlines, mostrar e verificar os resultados de exibição, Adicionar ao Manager e incluem furos (para gravar toda a área dentro do contorno). Escolha OK e registrar a área para cada célula a partir da janela de resultados.
- Identificar qual as células são transfectadas (Figura 6C).
- Identificar as áreas de degradação usando a imagem fluorescente de gelatina (Figura 6D). Se necessário, filtrar a imagem de gelatina para igualar a intensidade de fundo (ver 3.6). Limiar para selecionar as áreas de degradação, tomando nota das configurações de limite (Figura 6E). Em imagens subsequentes, utilizar estes mesmos valores de intensidade superior e inferior (utilizando o Conjuntobotão na janela Threshold) para uma selecção objectiva das áreas de degradação.
- Medir as áreas de degradação sob as células. Na imagem fluorescente limiarizada gelatina, mostram um resumo das células selecionando ROIs na janela do Gerenciador de ROI e seleção de Medida (Figura 6F). Registar os resultados e calcular a área normalizada de degradação / célula ou área de células.
5. Resultados representativos
O esquema geral para o processo é mostrado na Figura 1. O procedimento envolve a preparação de lamelas de vidro e revestimento com gelatina fluorescente conjugada, plaqueamento de células sobre as lamelas revestidas para permitir que as células de degradar a gelatina, que fixa e marcação das células para análise microscópica de fluorescência, imagem da matriz fluorescente para avaliar a integridade da matriz, e objectivamente a quantificação do grau de degradação da matriz de gelatina usando o computador software.
Figura 1. Esquemático geral ressaltando os principais passos envolvidos no revestimento de gelatina fluorescente de células de revestimento,, fixação e imunomarcação, e avaliando a proteólise da matriz.
Os principais passos processuais envolvidos na preparação e lamelas de vidro de revestimento estão descritos na Figura 2.
Figura 2. Esquemático mostrando as etapas individuais envolvidas na preparação de lamelas de vidro para o revestimento de matriz de gelatina. Passos realizados na luz (lâmpada acesa), em gelo (cubos) e no escuro (lâmpada não iluminado) são animados indicado. Passos realizados no escuro ajuda evitar fotodegradação das matrizes fluorescentes.
Quando adequadamente realizado, lamelas são uniformemente revestidas com verde Oregon 488-g conjugadoelatin, exibindo fluorescência homogénea quando visualizadas por microscopia (Figura 3A). Artefatos típicos que podem surgir devido ao revestimento impróprio, armazenamento, manuseio e uso de lamínulas revestidas são mostrados na Figura 3B.
Figura 3. Exemplos de artefactos encontradas durante a preparação de gelatina lamela revestida e manuseamento. A. vista ortogonal de um confocal z-stack mostrando a cor e consistência típica de um verde Oregon 488-conjugado lamela gelatina revestido produzido usando o protocolo prescrito. Lamelas deve ter um revestimento homogéneo ~ 1-2 mm de espessura, como mostrado na XZ (inferior) e (direita) YZ aviões confocal Artifacts B. que podem ocorrer durante o processamento do revestimento e revestidos com gelatina lamelas incluem:. Cobertura inadequada do lamela durante o processo de revestimento devidoa pobre solidificação, de mistura manual de espalhamento ou parcial da mistura de gelatina (revestimento desigual), a remoção da matriz revestida marcando com agulhas ou pinças durante o manuseamento (raspagem), a secagem da superfície lamela durante períodos de armazenamento prolongados, resultando em um paralelepípedo " "aparência (desidratado) e fotodegradação da superfície fluorescente gelatina durante o exame devido à exposição prolongada ou de alta intensidade de luz (branqueamento). Seta branca indica área branqueada abrangendo uma cabeça OSC19 banhado e pescoço do carcinoma de células escamosas. O Oregon Verde 488-conjugado gelatina é pseudocolored branco para melhorar o contraste da imagem. Bar, a 10 ^ m.
As matrizes resultantes finos produzidos durante este procedimento de proporcionar um meio sensível para avaliar a capacidade das células para se degradarem ECM. Figura 4 mostra um exemplo da actividade de uma célula invadopodia OSC19 plaqueadas numa Verde-488 Oregon lamela conjugado gelatinae representado por meio de microscopia confocal convencional, bem como, em volume, de enchimento de processamento de imagem na sequência de três desconvolução dimensional.
Figura 4. Exemplos representativos de invadopodia actividade degradação da matriz. A. Visualização de invadopodia e proteólise da matriz correspondente de gelatina. OSC19 células plaqueadas em Oregon Verde 488-conjugados lamelas de gelatina para 10 h foram fixadas e marcadas com rodamina-faloidina conjugada (F-actina) e os anticorpos anti-cortactina (visualizado com um Fluor Alexa 647 de anticorpo secundário e verde pseudocolored). Invadopodia são evidentes focais concentrações citoplasmáticas de F-actina e cortactina que se sobrepõem com áreas de gelatina de compensação (buracos escuros na matriz) dentro da imagem mesclada. Regiões caixas contendo setas indicam invadopodia individual e áreas de proteólise matriz focal como mostrado na re alargadaregiões abaixo. Bar, a 10 ^ m. B. Volume encher visualização de penetração invadopodia no ECM. OSC19 células plaqueadas e coradas como em (A) foram visualmente processado através da obtenção de 23 sucessivos 0,32 uM ópticos z fatias totalizando 7,04 mm para a rodamina-faloidina conjugada e Verde Oregon 488-conjugados de gelatina. O arquivo LSM conjunto nativo para cada canal foi inaugurado em software X2.2 Autoquant e uma deconvolução 3D cego de cada pilha de imagens foi realizada usando as configurações recomendadas (10 iterações, o ruído médio). As imagens processadas foram salvos como pilhas TIFF que foram abertas em Elementos NIS e processado como uma visão volume com mistura alfa. As LUTs foram ajustadas, e um subvolume foi criado para mostrar uma borda no interior da célula, onde invadopodia estão presentes. Dorsal beira-view demonstra invadopodia (vermelho, setas) inserido na gelatina subjacente (verde). Ventral de ponta vista mostra invadopodia protrusiva e áreas de degradação de gelatina debaixo da lamínulacomo regiões de presente vermelha na matriz verde (pontas de seta). O campo total da imagem apresentada é cortada para 77 x 65 m; célula é de aproximadamente 60 x 40 m.
A figura 5 mostra alguns dos passos importantes para a quantificação da degradação da matriz normalizada de gelatina, tal como descrito no passo 3 do protocolo. Este procedimento foi concebido para permitir a quantificação da degradação de gelatina imparcial em todo um campo de visão, e é adequado para a degradação da matriz atribuída a muitas células dentro do campo.
Figura 5. Ecrã imagens de captura demonstrando passos principais computacional assistida quantificação da degradação de gelatina normalizado para células dentro de uma imagem inteira microscópica como descrito no passo 3 do protocolo. Todas as imagens fluorescentes foram convertidas em tons de cinza para melhor visualizar a limiarização vermelho e marcações de ROI. A. Imidade de Oregon Verde 488-conjugado de gelatina, mostrando áreas escuras ("buracos") onde a degradação ocorreu (passo 3.4). B. limiarizada imagem gelatina destacando as áreas de degradação em vermelho (passo 3.5). Desenho C. mostrando ROIs medida para a área de degradação (passo 3.7). D. rodamina faloidina coloração da F-actina (passo 3.8.) E. limiarizadas imagem actina destacando área total de células em vermelho (passo 3.9). Desenho F. mostrando áreas de células a serem medidos (passo 3.10) . G. Imagem da DAPI manchado de núcleos de células (passo 3.13). H. Red descreve mostrar resultados de contagem de núcleos automático (passo 3.13). O filtro Watershed tem o potencial de núcleos separados que estão em contacto (seta branca). Se os núcleos sobrepõem-se extensivamente, eles não podem ser separados em objectos individuais (seta vermelha). Se um núcleo tem uma forma irregular, que pode ser separado em vários objectos (seta amarela). I. </> Resultados fortes de marcação núcleos durante uma contagem manual usando a ferramenta contador de células (passo 3.14).
Figura 6. demonstra os passos envolvidos na escolha fluorescente quantificar a degradação de gelatina com as células individuais dentro de uma população mista celular, conforme descrito no protocolo do passo 4. Aqui, degradação da matriz pelas células transfectadas podem ser analisadas dentro de uma população mista de células transfectadas e não transfectadas.
Figura 6. Tela capturar imagens das etapas envolvidas na quantificação da degradação de gelatina a partir de células transfectadas individuais dentro de uma população de células. Quantificação de uma única célula transfectada OSC19 cortactina overexpressing recombinante fundido com o marcador de epitopo FLAG é mostrado como um exemplo. Todas as imagens fluorescentes foram convertidos em tons de cinzento para mostrar melhor o thresholding vermelho e as marcações amarelas ROI. A. B. da área total de células com base em F-actina coloração após a aplicação do Umbral e analisar partículas funções (passo 4,2-3). C. imagem confocal de anti-FLAG imunomarcação da população de células mostrando uma única célula expressando-FLAG marcado cortactina (marcados com *) (passo 4.4.) Imagem de D. verde Oregon 488-conjugado gelatina, mostrando áreas escuras ("buracos"), onde a degradação ocorreu (passo 4.5) E. limiarizada imagem gelatina destacando as áreas escuras de degradação em vermelho (passo 4.5). F. limiarizada sobreposta imagem gelatina com contornos de células de painel B (passo 4.6). Observe que apenas os pixels de limiar definido, dentro dos contornos das células são contadas na análise. Áreas de degradação fora do local de célula corrente (seta branca) resultam da migração de células através da gelatina ao longo do tempo e não são included na análise.
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Discussion
A habilidade de visualizar as células que degradam a matriz extracelular ajudou na descoberta dos mecanismos moleculares utilizados nos passos iniciais da invasão celular. Lançado pela Wen-Tien Chen no início dos anos 1980 4,14,15, revestimento fluorescente etiquetado proteínas extracelulares em lamínulas para posterior análise microscópica emergiu como a principal técnica para avaliação da função invadopodia em uma ampla gama de tipos de células. O protocolo prescrito demonstra o método básico utilizado para a preparação de gelatina revestidas com lamelas de cobertura, que formam uma camada colagenosa menos de 2 mm de espessura adequada para a detecção da degradação da matriz extracelular pelas células mais convencionais microscópios fluorescentes e confocal 11,16-18, semelhante ao que tem foram anteriormente descritos 19-21. Estas propriedades permitem a rápida produção de lamelas revestidas capazes de detectar o aparecimento inicial de degradação da matriz. A sensibilidade proporcionada pelo the matriz de gelatina resultante fina nas subjacentes ajudas de vidro para superfícies duras que possam promover a formação em invadopodia como uma resposta à alta rigidez inerente do ambiente da matriz total 22. No entanto, estas matrizes não são bem adequados para a análise de invadopodia alongamento ou avaliação morfológica adicional que tenha sido conseguida usando mais espessa (30-100 mm) camadas de gelatina com metodologia similar, transwells revestidos ou microscopia electrónica 20,23,24.
Nós descobrimos que o pré-conjugado produzido comercialmente verde Oregon 488 gelatina permite a rápida montagem experimental acima e resultados consistentes e reproduzíveis. No entanto, a conjugação de borato alcalino de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para a gelatina não marcada permanece um método popular e barato para a produção de conjugados fluorescentes de gelatina 20. A fibronectina é também utilizada como uma proteína de matriz alternativa para a rotulagem e revestimento lamela 4,9 e, em alguns casos, emvestigators usaram fibronectina marcada em camadas sobre lamelas revestidas com gelatina não marcados para criar matrizes densas 11,25. Outras matrizes pode ser usada, dependendo das condições específicas do tipo de célula. Além de corantes no espectro verde nm 488, uma grande variedade de fluoróforos também têm sido utilizados com métodos de acoplamento manual para gerar lamelas com diferentes espectros de fluorescência, incluindo rodamina 21,26, Alexa Fluor 350 24, 546 21, 568 5,11 , 594 27 e 647 5 corantes. Tais conjugados são facilmente adaptáveis para utilização no protocolo prescrito, proporcionando a flexibilidade para a utilização de corantes específicos de proteína da MEC-combinações adequadas para a maior parte de qualquer conjunto de filtro de imagem.
As técnicas aqui descritos fornecem os passos necessários para a utilização detalhados ImageJ para quantificar a degradação da matriz de gelatina atribuídos a células individuais de uma população heterogénea de células ou de grupos inteiros como publicado previously 6,28. Software proprietário também tem sido empregada com sucesso para a mesma finalidade 5,25. Neste protocolo, a área da degradação da matriz é normalizado para um ou outro da área total das células ou o número total de células (núcleos) no campo. Geralmente, ambas as opções para normalização dará o mesmo resultado (ELW, dados não mostrados). No entanto, se as linhas de células diferentes com diferentes tamanhos de células estão a ser comparados ou se o tratamento experimental faz com que células para alterar o tamanho, então ele pode ser mais preciso para normalizar a quantidade de células. Por outro lado, muitas linhas celulares de cancro têm uma elevada percentagem de células multi-nucleadas, caso em que área celular total pode ser um parâmetro mais preciso para a normalização. Além disso, se apenas uma parte da célula é captada em imagem (Figura 6), pode ser melhor para normalizar a área da célula em vez de subestimar o potencial de degradação de uma célula individual. É importante para otimizar a análise de imagem para melhor ternoas características e nuances da configuração específica experimental.
Para a determinação do número de células em um campo cheio, contagem dos núcleos é frequentemente o método de escolha. ImageJ tem um plugin contador de núcleo para a contagem automática. Uma opção nesta ferramenta é o filtro de Bacias Hidrográficas. Este filtro vai ajudar núcleos separados que estão tocando por segregando-os em objetos individuais (Figura 5H, seta branca). No entanto, este filtro pode não ser capaz de separar os núcleos que se sobrepõem extensivamente (Figura 5H, seta vermelha). Além disso, se um núcleo tem uma forma irregular e grandes variações de intensidade, o filtro pode separar um único núcleo em vários objectos (Figura 5H, seta amarela). Portanto, é importante para tentar diferentes métodos de thresholding e alisamento deste plug-in para determinar os melhores parâmetros para análise. Se a contagem automática não produz números precisos, o plugin contador de células pode faci litate contagem manual das células ou núcleos.
Em casos de transfecção transiente utilizando, imagens, muitas vezes, contêm uma mistura de células que expressam ou que não expressam uma proteína de interesse (Figura 6). Neste cenário, o que nem sempre é aparente que as células eram responsáveis pela criação de áreas de degradação da matriz. Isto é especialmente verdadeiro se as células migram através da gelatina. Para ser coerente na análise, é importante apenas para medir as áreas degradadas diretamente abaixo de cada célula. Por thresholding para seleccionar as áreas escuras na matriz e utilizando a actina para gerar linhas de células, apenas as áreas degradadas sob as células irão ser quantificada. Este procedimento irá excluir áreas degradadas fora dos limites da célula de análise (Figura seta, 6F). O ensaio pode requerer otimização para selecionar um ponto de tempo que permite tempo suficiente para a degradação antes de as células tiveram a chance de se mover.
"> Numerosos métodos têm sido desenvolvidas para quantificar invadopodia formação e função. Para além da degradação da matriz, outros parâmetros frequentemente relatados incluem a determinação do número de invadopodia por célula, a percentagem de células que apresentam invadopodia dentro de uma dada população e o número de" imaturo "ou" pré "invadopodia não-degradantes em comparação com" maduro "invadopodia capazes de degradar a ECM 11,13,25,26. O método (s) de escolha para a avaliação invadopodia dependem das características inerentes de cada tipo de célula. Por exemplo, a contagem do número de células ou invadopodia por determinação da percentagem de células que contêm invadopodia é uma abordagem simples que funciona bem se as células analisadas contém apenas uns poucos invadopodia proeminente, mas torna-se mais difícil em células que têm dezenas de invadopodia ou onde invadopodia pode ser pequeno e difícil de detectar. Usando o ensaio de degradação torna possível calcular a percentagem de pré-invadopodia vs. invadopodia madura em células individuais ou em uma população através da comparação do número total de células com invadopodia à percentagem que são degradantes da matriz. Se existir uma discrepância que menos células são degradantes da matriz em comparação com células que apresentam invadopodia, isso pode indicar que as células são pré-formando invadopodia que eram incapazes de degradação da matriz no momento as células foram fixadas.Independentemente da combinação método escolhido para a análise, é importante quantificar as características desejadas invadopodia tão objetivamente quanto possível. Ao coletar imagens no microscópio, escolher campos de olhar para as células (actina), em vez de a matriz fluorescente, para evitar viés de seleção preferencial áreas com altos níveis de degradação. Várias imagens devem ser adquiridos para garantir uma representação justa da população celular. As imagens devem também ser adquiridas a um aumento apropriado. Para as populações uniformes de células, menor ampliação podeser utilizado para a recolha de mais células, enquanto as áreas de degradação ainda podem ser resolvidos. Imagens de alta ampliação são os preferidos para medir as áreas sob células individuais e para resolver invadopodia individual. Quando zonas são quantificados, limiar, com base em imagens de intensidade é maior do que objectivo escolhendo manualmente a área da matriz de medir. Em todos os casos, um número suficiente de células a partir de várias experiências independentes, deve ser analisado para dar estatisticamente significativas, resultados reprodutíveis.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por fundos de doações da West Virginia University Maria Babb Randolph Cancer Center. Agradecemos Susette Mueller (Georgetown University) e Laura Kelley para aconselhamento precoce e assistência. O uso da Universidade de West Virginia Facilidade imagens de microscopia (apoiado pela Babb Mary Randolph Cancer Center e, subvenções NIH P20 RR16440, P30 e P30 RR032138 GM103488) é reconhecido agradecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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