Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

פלישת הדור, טיהור ותא של aggresomes התאי, cytoplasmic אורך המלא DISC1 חלבון מתרביות תאים ומתויג בר, multimeric רקומביננטי DISC1 חלבון

Abstract

צבירת חלבון נתפסה כסימן היכר כללי של תנאי מוח כרוניים, ניווניות כמו, למשל, במחלות ניווניות מחלת אלצהיימר (Aβ, טאו), מחלת פרקינסון (α-סינוקלאין), מחלת הנטינגטון (polyglutamine, huntingtin), ואחרים. צבירת חלבון היא חשבה להתרחש עקב proteostasis המופרע, כלומר חוסר האיזון בין נובע ופירוק חלבוני misfolded. מן ראוי לציין כי את אותם החלבונים נמצאים מצטברים בצורות ספורדיות של מחלות אלו שמוטציה בגרסות נדירות של צורות משפחתיות.

סכיזופרניה היא מחלה כרונית פרוגרסיבית מוח שבמקרים רבים הולכים יחד עם גירעון הקוגניטיבי קבוע ובלתי הפיך. בגישת גן מועמד, אנחנו בדקנו אם 1 שבשנו ב-סכיזופרניה (DISC1), גן משובט במשפחה סקוטית עם הצמדה למחלה כרונית נפשית 1, 2, יכולה להימצא כאגרגטים מסיסים בbrain של מקרים ספוראדיים של סכיזופרניה 3. שימוש CC SMRI, זיהה בכ 20% ממקרים עם CMD אבל לא ביקורת רגילה או חולים עם מחלות ניווניות immunoreactivity DISC1 sarkosyl מסיס לאחר החלוקה ביוכימי. מחקרים מאוחרים יותר במבחנה גילו כי נטיית הצבירה של DISC1 הושפעה פולימורפיזם מחלה הקשורה S704C 4, ושDISC1 aggresomes שנוצר במבחנה היו תא פולשנית 5, בדומה למה שכבר הוכח לAβ 6, 7-9 טאו, α סינוקלאין-10, 11 polyglutamine, או SOD1 אגרגטים 12. ממצאים אלה הניעו אותנו להציע שלפחות משנה של מקרים עם CMD, אלה עם DISC1 המצטבר עלולים להיות הפרעות חלבון קונפורמציה.

כאן אנו מתארים כיצד אנו יוצרים DISC1 aggresomes בתאי יונקים, לטהר אותם בשיפוע סוכרוז ולהשתמש בם לStudi תא הפולשנותes. כמו כן, אנו מתארים כיצד אנחנו מייצרים C-מסוף DISC1 בר, תווית באופן בלעדי multimeric ולטהר אותו ללימודי הפולשנות סלולרית. שימוש בmultimers רקומביננטי של DISC1 להשיג הפולשנות תא דומה כמו לבר סינטטי שכותרת דומה α-סינוקלאין. אנו גם מראים שקטע זה נלקח בvivo כאשר מזריקים stereotactically לתוך המוח של בעלי חיים מושתלים.

Protocol

1. הכנת תאי תורם Aggresome: Transfection של אורך (eGFP)-תויג אנושי מלא (פלורידה) DISC1 חלבון monomeric האדום פלורסנט (mRFP) או חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר

  1. זרעי 1.5 x 10 6/10 סנטימטרי צלחת אדם נוירובלסטומה NLF (NLF; בית החולים לילדים של פילדלפיה, פילדלפיה, פנסילבניה) תאים ב10 סנטימטר 10 מנות ולגדול בין הלילה. תאי NLF מתורבתים ב- 1640 RPMI בינוני בתוספת 10% FBS, פניצילין / Strepomycin, L-גלוטמין. למחרת, תאים צריכים להיות ב70-80% confluency.
  2. Transiently transfect כל צלחת 10 סנטימטרים עם 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד ומגיב transfection Metafectene (Biontex, Martinsried, גרמניה). בקיצור, למנה בסנטימטר 10, דנ"א 15 מיקרוגרם פלסמיד וMetafectene μl 30 נוספו 750 μl Opti-MEM, מעורבים והודגרו ב RT במשך 20 דקות. 5 מנות היו transfected עם pcDNA3.1 mRFP / eGFP מתויגת-אדם (פלורידה) וDISC1 5 מנות עם eGFP-פלסמיד לבד.

2. Aggresomeטיהור מתורם בתאי transfected

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שילוב של שיטה לטהר Lewy-גופים מרקמת המוח 13 ופרוטוקול לבודד אגרגטים וaggresomes 14 גדולים. מאחר שכבר קיימות שיטות המבוססות על השימוש בחומרי ניקוי, הבידוד של חלבון אבקה נטולה ליישום במבחני תא הפולשנות הוא קריטי.

  1. 48 שעות לאחר transfection, לעקוב אחר הביטוי של eGFP וmRFP/eGFP-DISC1 ולאשר את הקמתה של aggresomes תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1).
  2. לשטוף את התאים עם PBS pH 7.4, לגרד עם 400 PBS μl כל, להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז 1X (רוש, אינדיאנפוליס, אינדיאנה) ולשבש את התאים באמצעות Precellys24 homogenizer (טכנולוגיות רטין, צרפת). בקצרה, להוסיף השעית תא 1 מ"ל לצינור 2 מיליליטר תמוגה ולהוסיף 10 חרוזי קרמיקה. Lyse התאים עם 3 60 פולסים x שניות. הכח המכאני של התהליך עלוללהגדיל את הטמפרטורה בתוך המדגם מעל 37 מעלות צלזיוס ולכן יש להקפיד לצנן את המדגם על קרח לאחר הליך תמוגה.
  3. לקרר את התאים על קרח ולהוסיף 10 mM MgCl 2, 40 U / ml DNase ודגירה במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס
  4. הכן את פתרונות של 80%, 50%, 20% סוכרוז (w / v) בחומציות PBS 7.4 (10 מ"ל כל אחד).
  5. הכן את שיפוע סוכרוז בצינור 15 מ"ל בז, החל המ"ל סוכרוז 2 80%, ואחריו 50% ו 20%. יוצק את השיפוע לאט ולהיזהר לא להפריע לשכבות כבר זרמו. שכבת lysate מתעכל על גבי השיפוע וצנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1000 XG ב 4 ° C.
  6. זהירות לאסוף שלבי ביניים בין 50-80% סוכרוז השכבה עם פיפטה ולערבב עם 5 כרכים של PBS pH 7.4. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1000 XG ב 4 ° C. חזור על שטיפת פעמים נוספות. בinterphase זה, aggresomes הוא ניאון ויכול להיות חזותי במיקרוסקופ תחת אור UV.
  7. בטל supernatant וresuspend גלול ב pH PBS μl 250-500 7.4. גלולה זו מכילה מטוהרי aggresomes (איור 2).

3. טיפול בתאי נמען SH-SY5Y עם mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes

  1. זרעים 5 x 10 4 תאי neuroblastoma אדם SH-SY5Y נמען constitutively להביע GFP-DISC1 (598-854) בcoverslips זכוכית סטריליים בכל היטב של צלחת גם 24. תא SH-SY5Y מתורבת בDMEM/F-12 בינוני בתוספת חומצות פניצילין / סטרפטומיצין, שאינן חיוניות אמינו (NEAA) ו10% FBS.
  2. 24 שעות מאוחר יותר, להוסיף 10 μl לכל באר ודגירה במשך 48-72 שעות.
  3. לשטוף את תאי 3 X עם PBS pH 7.4 ולהרוות פלואורסצנטי התאי עם 0.04% Trypan הכחול למשך 5 דקות.
  4. לתקן את התאים עם 4% PFA ב PBS pH 7.4 למשך 10 דקות על קרח, לשטוף פעם אחת עם H 2 O סטרילית ולעגן את coverslips על שקופיות זכוכית עם להאריך את הזהב עם DAPI הרכבה בינונית (Invitrogen, ארה"ב).
  5. לאשר את הספיגה /פלישה לaggresomes מיושם exogenously ידי colocalization עם חלבונים שגויסו לידי ביטוי על ידי תאי נמען בתמונות Z-מחסנית.

עם זאת, ספיגה / פלישה של חלבון אקסוגני אולי לא במהות להתגלות במקביל לגיוס של חלבון תא מארח. בדוגמא שלנו mRFP-תויג DISC1 aggresomes לגייס מסיס GFP-tagged DISC1 (598-854) חלבון מתבטא בתא המארח (ראה איור 3). תמונות צולמו על Zeiss LSM 510 confocal או מיקרוסקופ Zeiss AxioVision Apotome2.

4. הדור של DISC1 רקומביננטי (598-785)

בפרסום קודם נתחנו את היכולת של DISC1 ברי חלבונים שונים לאינטראקציה עצמית מבוסס על הנוכחות של דומיינים עמותה עצמית. בין כל החלבון שברי אדם נבדק DISC1 (598-785) מוצג נטיית multimerization החזקה 4 (איור 4). לכן, האדם DISC1 (598-785) שוכפל לpET15b (איןאגן ונמצא במדיסון, ויסקונסין) המכיל N-מסוף תג 6-היסטידין, המתבטא בE. coli-BL21 (lDE3) רוזטה (Novagen, ארה"ב), ומטוהר בתנאי denaturing באוריאת 8 mol / L כמתואר 4. בקיצור, הפרוטוקול מפורט להלן.

  1. BL21-(IDE3) רוזטה E. coli גודל ב2 x 500 מיליליטר 2YT המכיל עד 5 מ"מ ארגינין-HCl, 5mm MGSO4, 100 מיקרוגרם / המ"ל carbencillin, 35 מיקרוגרם / המ"ל chloramphenicol לOD 600: 0.6-0.8 וDISC1 (598-785) הביטוי היה מושרה עם IPTG 1 מ"מ.
  2. DISC1 (598-785) בא לידי הביטוי במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, הביטוי הופסק על ידי איסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה.
  3. גלולת החיידקים הייתה resuspended ב50 מ"ל TE חיץ (50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 המ"מ EDTA) בתוספת המ"מ PMSF 2, 1% TX-100, 250 מיקרוגרם / המ"ל Lysozyme, 20 מ"מ U/50 מיליליטר MgCl 2 ו 400 DNase I. כדי להבטיח תמוגה מלאה, תגובת הודגר למשך 30 דקות ב RT עם ערבוב עדין.
  4. הוסף 10 mM β-mercaptoethanol (ME) ו500 המ"מ NaCl ודגירה במשך 30 דקות נוספות.
  5. ספין למטה גופי הכללת חיידקים ב20.000 גרמו למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  6. Resuspend גלולה בחיץ חילוץ מ"ל המכיל 50 טריס pH 50mm 8.0, המ"מ imidazole 5, mM NaCl 500, אוריאה וז 8 מ"מ 10 β-ME ולהסיר שאריות ידי צנטריפוגה ב20.000 גרמו למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  7. שטוף Ni-נ.ת. ע agarose המטריצה ​​עם חיץ חילוץ. דגירת תמצית resuspended, precleared חלבון עם Ni-נ.ת. ע למטריצת 2 שעות בRT.
  8. שטוף Ni-נ.ת. ע המטריצה ​​עם חיץ מיצוי המכיל 12 המ"מ imidazole.
  9. Elute החלבון לאט עם חיץ elution מ"ל 15 המכיל 50 המ"מ טריס, 500 mM NaCl, 300 המ"מ imidazole, ז 8 אוריאה, 1 המ"מ PMSF, mM EDTA 5 ו 10 מ"מימ β-ME.
  10. דיאליזת חלבון השלבים לPBS pH 7.4 המכיל 10 מ"מ β-ME.

מתרבות 1 ליטר חיידקים מתחילים זה אפשרי לבודד עד 50 מ"ג של DISC1 רקומביננטי (598-785) protעין.

refolding α-סינוקלאין

לניסויים עם α-סינוקלאין, 500 מיקרוגרם של חלבון רקומביננטי (סיגמה אולדריץ, ארה"ב) התפרקו ב PBS בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. כדי להשיג oligomers, מקפל בוצע לילה על 37 מעלות צלזיוס כפי שתואר בפרסום קודם 10.

5. תיוג של DISC1 רקומביננטי (598-785) עם DyLight594

  1. לפני התהליך עוקב התיוג, DISC1 (598-785) החלבון להשתחרר מβ-ME. לכן, חלבון הדיאליזה 3 פעמים לPBS pH 7.4 בדילול של 1:2,000.
  2. תווית 1 מ"ג DISC1 (598-785) עם DyLight 594 maleimide (Thermo Scientific, ארה"ב) על פי הוראות היצרן. בקיצור, לפזר 1 מ"ג / מיליליטר חלבון ב PBS pH 7.4 ולהוסיף TCEP 5 מ"מ להתאושש קבוצות thiol בחינם. הוסף 20 μl של צבע DMF המומס לתגובה והדגירה במשך 2 שעות בRT.
  3. דיאליזת 3 x החלבון לPBS pH7.4 בכל יחס של 1:2000 ל2 שעות כל אחד.

כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של החלבון שכותרתו 6-תויג זיקה לטיהור מבוססת על עמודת Ni-נ.ת. ע מתבצעת.

  1. שטוף 1 המ"ל Ni-נ.ת. ע מטריצה ​​(Qiagen, גרמניה) עם 10 המ"ל PBS pH 7.4.
  2. החל החלבון המסומן, הדיאליזה לעמודה ולתת לו לרוץ על העמודה לאט.
  3. שטוף את החלבון עם רמת חומציות 3 x 20 מיליליטר PBS 7.4
  4. Elute חלבון עם PBS pH 7.4, 500 mM imidazole dropwise תוך ניטור הלהקה הצבעונית על עמודת Ni-נ.ת. ע להפחתת נפח eluate.
  5. דיאליזת 3 X eluate עד 10 מ"מימ NaPi pH 7.4 בדילול של 1:2000 ל2 שעות כל אחד.
  6. השתמש במזרק מיקרומטר סטרילי 0.45 מסנן כדי לסנן eluate, aliquot ב5 100 דגימות x μl והקפאת צמד בחנקן נוזלי. הסכום הכולל של חלבון צריך להיות 0.5 - מיקרוגרם 1 / מ"ל ​​בכל aliquot μl 100.

concentr האופציונליצעד ation

  1. לחולדות זריקות stereotactical, החלבון היה מרוכז 10-לקפל ב( מרוכז אפנדורף 5301) מהירות-VAC. מצב החיץ הסופי היה NaPi mM 100.

תיוג α-סינוקלאין

התיוג והטיהור (עמודת Ni-נ.ת. ע) של רקומביננטי α-סינוקלאין בוצע במקביל לDISC1 (598-785). סך הכל החומר ההתחלתי היה 500 מיקרוגרם במקום 1 מ"ג לDISC1 (598-785).

6. טיפול בתאי נמען SH-SY5Y עם DISC1 רקומביננטי שכותרתו (598-785) חלבון

  1. 5x10 4 תאי זרע נמען SH-SY5Y אדם neuroblastoma constitutively להביע GFP-DISC1 (598-854) בcoverslips זכוכית סטריליים בכל היטב של צלחת גם 24.
  2. הוסף חלבון מסומן למדיום תרבית התאים בריכוז של מיקרוגרם / מ"ל ​​5-10 ודגירה במשך 48-72 שעות.
  3. לשטוף את תאי 3 X עם PBS pH 7.4 ולהרוות extracפלואורסצנטי ellular עם 0.04% Trypan כחול למשך 5 דקות.
  4. לתקן את התאים עם 4% PFA ב PBS pH 7.4 למשך 10 דקות על קרח, לשטוף פעם אחת עם H 2 O סטרילית ולעגן את coverslips על שקופיות זכוכית עם להאריך את הזהב עם DAPI הרכבה בינונית (Invitrogen, ארה"ב).
  5. לאשר את הספיגה / פלישה לexogenously מיושמת חלבון רקומביננטי ידי colocalization עם חלבונים שגויסו לידי ביטוי על ידי תאי נמען בתמונות Z-מחסנית שנוצרו על ידי סריקת הליזר מיקרוסקופ confocal. עם זאת, גיוס של חלבון אנדוגני אולי לא במהות להתגלות במקביל לפלישה של חלבון תא מארח, תמונות Z-מחסנית יכולות עדיין לאשר את האופי הפולשני של החלבון.

בדוגמא שלנו rec. DISC1 (598-785) * לפחות בחלק מגויסים המסיסים GFP-tagged DISC1 (598-854) חלבון מתבטא בתא המארח (ראה 5 איור). לרקומביננטי פלישת α-סינוקלאין אבל אין גיוס מוצג (5B איור). תמונות צולמובZeiss LSM 510 confocal או מיקרוסקופ Apotome2 Zeiss AxioVision.

ההזרקה המרוכזת (4 μl בקירוב של 2.5 מיקרוגרם / μl), שכותרתו DISC1 (598-785) * לתוצאות mPFC בהפצה של החלבון סביב מקום הזריקה שיכול להתגלות גם לאחר טפטוף של בעלי החיים עם 4% PFA ב PBS pH 7.4 עם filterset rhodamine. בדוגמא שלנו DISC1 (598-785) הוא נלקח על ידי מספר ייחודי של תאי עצב ויכול להיות פיקוח עם Z-מחסנית הדמיה (איור 6).

באופן כללי, ההזרקה של חלבונים אחרים ולאחר מכן את אלה המשמשים כאן לא בהכרח תוביל לתא פלישה. אירוע הפלישה הוא למעשה תלוי באופי של החלבון, בכל זאת טיהור נקיה היא תנאי הכרחי לניתוח נוסף.

7. נציג תוצאות

Aggresomes מורכב רקומביננטי פלורידה DISC1-eGFP מטוהרים מתאי NLF פלש הנמען SH-SY5Y ceLLS ביעילות נמוכה (כ 0.3% 5) כפי שניתן לראות על ידי colocalization עם מיקרוסקופיה confocal (איור 3). כפי שדווח בעבר, DISC1 (598-785) הביע ומטוהר מE. coli נוצר multimers 4 היו שווה תא פולשנית ביעילות של כ 20% 5 (האיור 5A) דומים לזו של α-סינוקלאין ששמשה במקביל כביקורת חיובית (5B איור). DISC1 רקומביננטי שכותרתו (598-785) הביע ומטוהר מE. coli היה גם תא פולשנית לנוירונים in vivo כאשר חלבון multimeric הוזרק stereotactically לתוך קליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי של עכברוש (איור 6; pum, בדר, יוסטון, קורט, לא פורסם).

איור 1
איור 1. תאי neuroblastoma NLF transiently להביע FP-DISC1 (אדום). aggresomes ניאון אדום יכול להיות detected בתוך התאים.

איור 2
האיור 2. מטוהר mRFP-תויג DISC1 aggresomes לאחר הטיהור בשיפוע סוכרוז.

איור 3
איור 3. תמונה של פלורסנט aggresomes פלש. flDISC1 aggresomes mRFP מתויג-טוהר ודגר עם תאי neuroblastoma SH-SY5Y overexpressing מסיס GFP-tagged DISC1 (598-854). ספיגה של aggresomes כותרתו היא פיקוח על ידי הדמית Z-מחסנית במיקרוסקופ ליזר סריקה (Zeiss LSM 510).

איור 4
איור 4. SEC-פרופיל של rec. DISC1 (598-785) המכיל S704 וC704 פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחידים (SNP). שני הגרסות להראות שיבוש oligomerization הורה והיווצרות mult משקל המולקולרי הגבוהimers (חץ אדום). תמונה זו היא שונה מפרסום Leliveld et al., ביוכימיה 2009.

איור 5
איור 5. תמונת Z-מחסנית של פלורסנט DISC1 פולשנית DyLight שכותרת רקומביננטי (598-785). תאי neuroblastoma SH-SY5Y להביע GFP-DISC1 המסיס (598-854) הודגרו עם הכותרת, רקומביננטי חלבון בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל. () אגרגטים אדומים מציגים את הפלישה של rec. DISC1 חלבון (598-785) ונקודות צהובות עולים גיוס של ה-GFP-DISC1 המסיס (598-854) לאגרגטים. (ב) רקומביננטי α-סינוקלאין (אדום) פולש לתאים מבלי גיוס בתדירות של כ 20%. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. תמונה של Immunofluorescent, DISC1 הזריק כותרת רקומביננטי (598-785) החלבון. הדמית Z-מחסנית מאשרת את קיומו של rec. DISC1 (598-785) חלבונים בנוירונים בקליפת מוח חולדה מוכתמת עם נוגדן נגד גרעין עצבי (NeuN, ירוק).

Discussion

במחקר זה אנו מתארים טיהור mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes מקו transfected נוירובלסטומה תא, ההכנה ותיוג של DISC1 מיני חלבון רקומביננטי והיישום שלהם בניסויי תא פלישה של תאי נמען במבחנת in vivo.

טיהור mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes ילידים פותחה מתוך פרוטוקולים לבודד מבנים לוי גוף דמויים ואגרגטים גדולים 13, 14, אבל שונה כדי להימנע מהשימוש בחומרי ניקוי וכדי למזער את הסיכון של תא פלישה חיובית כוזב שעלולה להתרחש עקב חדירת חומר ניקוי קרום הקל.

שיפור עתיד אפשרי אחד יכול להיות בהמשך להגדיל את הטוהר של aggresomes ידי sonication ללחלוטין קרומים שנותרו נפרדים וcytoskeleton מaggresomes. על ידי טוהר כולל גובר, מספר אירועי פלישה כלל שנרשם לaggresomes ma גדולy להיות מוגבר 5. אם בהגדרה המצומצמת של סוכרוז הציע 3-השלב די לaggresomes של מיני חלבון אחרים יש להיבדק, במובן זה הפרוטוקול המתואר כאן צריך להיחשב כנקודה מוצאת לקידום פרט. את aggresomes המטוהר הוכיח להיות די חזק בידות שלנו, שלבי כביסה נוספים (ללא חומרי ניקוי) לחסל את העקבות של סוכרוז לא להפחית באופן משמעותי את התשואה הכוללת.

בפרסום קודם שתארנו שהרכבת oligomer של DISC1 תלויה בתחומי multimerization נפרדים בתחנה הסופית של C-4 (איור 4). בחרנו קטע זה לביטוי רקומביננטי המסיס בE. coli ושלאחר מכן וטיהור Ni-נ.ת. ע. כדי לפקח multimerization ולהשוות את הפולשנות התא שלה עם חלבון תאר תא פולשנית כמו α-סינוקלאין, אנחנו מתויגים DISC1 (598-785) עם צבע פלואורסצנטי DyLight594, ולעומתהתא הפולשנות עם זה של תווית באופן שווה α-סינוקלאין. תא הפולשנות של DISC1 בר רקומביננטי הייתה גדל באופן דרמטי בהשוואה לזה של ילידי אורך מלא DISC1 aggresomes, כנראה עקב גודל קטן יותר וטוהר גבוה בהרבה. שוב, טוהר נראה לשחק תפקיד מכריע בתא הפולשנות.

בדוגמא שלנו את aggresomes פולשניים גייס חלבון מסיס homologue של קו תא היעד שהתבטא recombinantly בצורה מסיסה, כלומר תא מפוזר-. הביטוי של חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP או RFP) בשורת תאי הנמען הוא יתרון שכן הוא מאפשר colocalization של aggresomes פולשניים וחלבונים רקומביננטיים בתוך מגבלת תא הנמען באמצעות הדמית Z-מחסנית.

aggresomes DISC1 תאים פולשניים ושברי multimeric הביעו ומטוהר מE. חיידק יכול להיות תכונה מגדירה של מחלות קונפורמציה חלבון הנוגעים לDISC1, DISC1opathies 15.

צרות קליעה:

תשואה נמוכה aggresome לאחר טיהור שיפוע סוכרוז:

שיפוע סוכרוז הציג בפרוטוקול זה עובד היטב עם aggresomes eGFP/mRFP-DISC1 (פלורידה). Aggresomes המורכב של חלבונים אחרים עשויה להיות מידות משתנות ולכן ריכוזי סוכרוז צריכים להיות מותאמים על ידי משתמשים אחרים.

טיהור בלתי מספקת של חלבון רקומביננטי:

כל זיהום חיידקים בתהליך הטיהור של חלבון רקומביננטי גם להיות מתויג בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. כדי להימנע מזיהומים, להפעיל את החלבון על SDS-PAGE ולוודא כי חלבון רקומביננטי הוא לפחות 95% טהור ע"י השאיר עם Coomassie הכחול. כדי להבטיח איכות ואת התשואה הגבוהה ביותר, בפרוטוקול יש להיות מותאם לכל חלבון בודד.

נמוך התיוג EFficiency של חלבונים רקומביננטיים:

כל זיהומים שמכילים קבוצות SH חופשיות יקטנו תיוג יעיל של החלבון. לכן, דיאליזה נרחבת וטיהור מבוססת Ni-נ.ת. ע הוא חובה.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NEURON-Eranet גלה (BMBF 01EW1003) לCK וJPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) לCKVB נתמך על ידי מענק של Forschungskommission של הפקולטה לרפואה באוניברסיטת דיסלדורף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
Table of recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  2. St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
  3. Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
  4. Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
  5. Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
  6. Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
  7. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
  8. Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
  9. Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
  10. Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
  11. Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
  12. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
  13. Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
  14. Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
  15. Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter