Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

doi: 10.3791/4132 Published: August 30, 2012

Summary

Hücre kültüründen hücre içi, sitoplazmik tam uzunluklu protein DISC1 aggresomes ve bir etiketlenmiş, multimerik DISC1 rekombinant protein parçasının üretimi, saflaştırılması ve hücre istilası

Abstract

Protein toplama Alzheimer hastalığı (Aβ, tau) nörodejeneratif hastalıklarda, örneğin, gibi kronik ve dejeneratif beyin koşulların bir genel ayırt edici olarak görülen, Parkinson Hastalığı (α-sinüklein), Huntington hastalığı (poliglutamin, huntingtin), ve diğerleri. Protein agregasyonu rahatsız proteostasis sonucu oluştuğu düşünülmektedir, doğan ve katlanan proteinlerin yıkımı arasındaki dengesizlik yani. Not, aynı protein ailesel formları arasında ender türevleri mutant bu hastalıklar dağınık formlar toplanmış bulunur.

Şizofreni birçok durumda kalıcı ve geri dönüşümsüz bilişsel açığı ile birlikte gider kronik ilerleyici beyin hastalığıdır. Aday gen yaklaşımı, biz bozulması-in-şizofreni 1 (DISC1), kronik ruhsal hastalığı 1, 2 bağlantı ile bir İskoç aile klonlanmış bir genin, brai çözünmez büyüklükler bulunamadı araştırdıkn şizofreni 3 sporadik olgular. SMRI CC kullanarak, CMD ile vakaların yaklaşık% 20'sinde belirlendi ancak biyokimyasal fraksiyonasyonu sonrası nörodejeneratif hastalıklar ile değil normal kontrollerde veya hasta sarkosyl çözülmeyen DISC1 immünreaktivitesi. In vitro sonraki çalışmalar DISC1, toplama eğilimi hastalığı ile ilişkili polimorfizmi S704C 4 etkilendiğini ortaya koydu ve in vitro üretilen DISC1 aggresomes Aβ 6 için gösterilen olmuştu ne benzer 5, tau 7-9, α hücre-invaziv olduğu -sinüklein 10, poliglutamin 11 veya SOD1 agregalar 12. Bu bulgular bize CMD olguların en azından bir alt kümesi, toplanan DISC1 olan proteinin konformasyon bozuklukları olabileceğini teklif istenir.

İşte biz memeli hücrelerinde DISC1 aggresomes oluşturmak nasıl açıklar, bir sukroz degrade onları arındırmak ve hücre-invaziv Studi için bunları kullanmakes. Benzer şekilde, biz sadece bir multimerik C-terminal DISC1 fragmanı, etiket üretmek ve hücre invaziv çalışmalar için arınmak anlatılmaktadır. DISC1 yeniden birleştirici multimerler kullanılarak bir benzer bir şekilde etiketlenmiş sentetik α-sinüklein fragmanı için olduğu gibi benzer hücre invaziv elde edin. Ayrıca stereotaktik alıcı hayvanların beyin içine enjekte edildiğinde bu fragman, in vivo alınır olduğunu göstermektedir.

Protocol

1. Aggresome Donör Hücre Hazırlanması: Monomerik Kırmızı Floresan Protein (MRFP) veya Gelişmiş Yeşil floresan proteini (eGFP) etiketli İnsan Tam Boy (FL) DISC1 transfeksiyonu

  1. Tohum 1.5 x 10 6/10 cm çanak insan nöroblastom NLF (NSG, Philadelphia Çocuk Hastanesi, Philadelphia) on 10 cm yemekleri hücreleri ve gecede büyümek. NLF hücreleri% 10 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde kültürlenmiştir FBS, penisilin / Strepomycin, L-Glutamin. Ertesi gün hücreler,% 70-80 konfluense olmalıdır.
  2. Geçici olarak 15 ug plasmid DNA ile Metafectene transfeksiyon reaktifi (Biontex, Martinsried, Almanya) ile her biri 10 cm tabak transfekte. Kısaca, 10 cm tabak için, 15 ug plazmid DNA ve 30 ul Metafectene, 750 ul Opti-MEM ile karıştırılmış ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. 5 yemekleri pcDNA3.1 MRFP / eGFP-plazmid ile yalnız eGFP etiketli insan (FL) DISC1 ve 5 yemekleri ile transfekte edildi.

2. AggresomeTransfekte Donör Hücrelerden Arındırma

Burada açıklanan protokol beyin dokusunda 13 ve büyük agrega ve aggresomes 14 yalıtmak için bir protokol Lewy-Oluşumu arındırmak için bir yöntem bir kombinasyonudur. Zaten mevcut olan yöntemler deterjan kullanımı, hücre-invaziv deneylerde uygulama için deterjan içermeyen protein izolasyon dayandığı için kritik önem taşır.

  1. Transfeksiyondan 48 saat sonra, eGFP ve mRFP/eGFP-DISC1 ifade izlemek ve flöresanlı bir mikroskop (Şekil 1) altında aggresomes oluşumu teyit.
  2. 1X Proteaz önleyici kokteyl eklemek (Roche, Indianapolis, IN) ile bir Precellys24 homojenizör (Bertin teknolojiler, Fransa) kullanılarak hücrelerin bozmak, PBS pH 7.4, 400 ul PBS ile her bir kazıma ile yıkayın hücrelerini. Kısaca, bir 2 ml parçalama tüp 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin ve 10 seramik boncuklar ilave edin. 3 x 60 sn darbeleri ile hücrelerin parçalayıcı. Sürecin mekanik kuvvet olabilir37 Yukarıdaki örnek içindeki sıcaklık artışı ° C nedenle bakım lizis işleminden sonra buz üzerinde örnek chill alınmalıdır.
  3. Buz üzerinde soğutulur ve 37 hücreleri, 60 dakika boyunca 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A ve inkübe ° C ekleyin
  4. % 80 çözeltileri,% 50, PBS, pH 7.4 (10 ml her biri) içinde% 20 sakaroz (w / v) hazırlayın.
  5. En az% 50,% 20, ardından 2 ml% 80 sakaroz ile başlayarak, bir 15 ml tüp içinde şahin sakaroz eğim hazırlayın. Yavaş degrade dökün ve zaten döktü katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. 4 at Katman 1000 xg'de 15 dakika degrade ve santrifüj üstüne sindirilmiş lizat ° C.
  6. Dikkatlice PBS pH 7.4 5 ciltlik bir pipet ve karışımı ile% 50-80 sakkaroz katmanı arasındaki interfaz toplamak. 4 ° C'de 1000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüje Iki ek kat çamaşır tekrarlayın. Bu interfaz yılında aggresomes floresan ve UV ışık altında bir mikroskop gözlenebilir.
  7. Süpernatantı atın ve250-500 ul PBS pH 7.4 içinde pelet tekrar süspansiyon. Bu topak saflaştırılmış aggresomes (Şekil 2) içerir.

3. MRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes ile Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi

  1. Tohum 5 x 10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade. SH-SY5Y hücre Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitler (NEAA) ve% 10 FBS ile takviye DMEM/F-12 ortamında kültüre edilir.
  2. 24 saat sonra, her bir kuyunun 10 ul ekleyin ve 48-72 saat süreyle inkübe edin.
  3. PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve 5 dakika için% 0.04 'Tripan Mavisi ile hücre dışı floresan gidermek.
  4. Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 'de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin.
  5. / Alımını onaylaZ-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından dışarıdan uygulanan aggresomes işgali.

Ancak, eksojen protein alımını / işgali aslında konak hücrenin protein alımı ile paralel olarak tespit edilemeyebilir. Bizim örneğimizde MRFP etiketli DISC1 aggresomes işe çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854) konak hücre (bkz. Şekil 3) tarafından ifade edilmiş protein. Resimleri bir Zeiss LSM 510 konfokal-veya Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop alınmıştır.

4. Rekombinant DISC1 Üretimi (598-785)

Bir önceki yayında biz öz-örgütlenme alanlarının varlığına dayalı öz-etkileşim için çeşitli DISC1 protein parçalarının yeteneği analiz. Tüm protein arasında insan DISC1 (598-785) (Şekil 4) güçlü multimerization eğilimi 4 görüntülenen test parçaladı. Bu nedenle, insan DISC1 (598-785) (Resim pET15b içine klonlandıvagen, Madison, Wisconsin) olarak ifade E. 6-histidin etiketi bir N-terminal içeren, coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, ABD), ve 4 açıklandığı gibi 8 mol / l üre denatüre edici koşullar altında saflaştınldı. Kısaca, protokol aşağıda verilmiştir.

  1. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli bir OD 600 5mM 5 mM-arginin-HCl, MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol içeren yukarı 2 x 500 ml 2YT içinde büyütülmüştür: 0.6-0.8 ve DISC1 (598-785) ifade endüklenmiştir 1 mM IPTG ile.
  2. DISC1 (598-785) 37 ° C 'de 4 saat boyunca ifade edildi ifade santrifüjleme ile hasat bakteriler tarafından sona erdirildi.
  3. Bakteri pelet, 50 ml TE tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA) artı 2 mM PMSF,% 1 TX-100, 250 ug / ml lizozim, 20 mM MgCl2 ve 400 U/50 ml içinde tekrar süspanse eridiği sağlamak için DNase I, reaksiyon hafif karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika süre ile inkübe edildi.
  4. Β-mercapt 10 mM ekleBaşka bir 30 dakika boyunca oethanol (ME) ve 500 mM NaCI ve inkübe.
  5. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 g'de bakteri inklüzyon gövdelerinin aşağı Spin
  6. Yeniden süspanse pelet 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM β-ME ve 4, 30 dakika boyunca 20.000 g'de sentrifüjleme ile artıkları kaldırmak ° C ihtiva eden 50 ml tampon içinde ekstraksiyon
  7. Ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA agaroz matrisi yıkayın. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle Ni-NTA matris ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş precleared protein ekstresi inkübe edin.
  8. 12 mM imidazol içeren ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA matrisi yıkayın.
  9. 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M üre, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA ve β-ME 10 mM ihtiva eden 15 ml elüsyon tamponu ile yavaş yavaş protein Zehir.
  10. Β-ME 10 mM PBS, pH 7.4 ile adım adım protein Dialyze.

1 L bakteriyel başlangıç ​​kültürü kaynaktan rekombinant DISC1 (598-785) prot 50 mg'a kadar izole etmek mümkündürein.

α-sinüklein refolding

Için, α-sinüklein, rekombinant protein 500 mg (Sigma-Aldrich, USA) ile deneyler 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda PBS içinde çözüldü. Oligomerler elde etmek için, refolding 37 gece boyunca gerçekleştirildi ° C gibi daha önceki bir yayında 10 tanımlanmıştır.

5. DyLight594 ile Rekombinant DISC1 (598-785) Etiketleme

  1. Önceki sonraki etiketleme süreci, DISC1 (598-785) proteini β-ME kurtulmuş oldu. Bu nedenle, protein 1:2,000 bir seyreltme PBS pH 7,4-3 kez diyaliz edilir.
  2. Etiket 1 üreticinin talimatlarına göre DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) mg DISC1 (598-785). Kısaca, PBS pH 7.4 içinde 1 mg / ml protein çözülür ve serbest tiyol gruplarının geri kazanmak için 5 mM TCEP ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe etmek ve reaksiyon DMF boya çözünmüş 20 ul ekle.
  3. PBS pH protein 3 x Dialyze2 1:2000 oranında 7.4 her biri HR.

İlave etiketli protein saflık artırmak için bir His 6-etiketli bir Ni-NTA sütunu gerçekleştirilir üzerinde afiniteyle saflaştırılması bazlı.

  1. 10 ml PBS pH 7.4 ile 1 ml Ni-NTA matris (Qiagen, Almanya) yıkayın.
  2. Sütun etiketli, diyalizlenmiş protein uygulayın ve yavaşça sütunu üzerinde çalışmasına izin.
  3. 3 x 20 ml PBS, pH 7.4 ile yıkanır protein
  4. Eluat hacmini azaltmak için Ni-NTA sütun üzerindeki renkli bant izlerken PBS pH 7.4, 500 mM imidazol damla damla ile protein Zehir.
  5. 2 saat için her bir 1:2000 seyreltme bir 10 mM NAPI pH 7.4 ile arındırıldı ve 3 x Dialyze.
  6. Eluat, sıvı azot içinde 5 x 100 ul örnekleri ve ek dondurucuda kısım filtreler.İnteger steril 0.45 mikron şırınga kullanın. Her bir 100 ul alikot içinde 1 ug / ml - protein olarak toplam miktarı 0.5 olmalıdır.

isteğe concentrtirme adım

  1. Stereotaktik sıçan enjeksiyonlar için, proteinin bir hız-vac (Eppendorf Concentrator 5301) 10 kat konsantre edildi. Nihai tampon durum 100 mM NAPI idi.

α-sinüklein Etiketleme

Rekombinant α-sinüklein bir etiketleme ve arıtma (Ni-NTA sütunu) DISC1 (598-785) ile paralel olarak yapılmıştır. Toplam başlangıç ​​malzemesi 500 mg yerine DISC1 (598-785) için 1 mg idi.

6. Etiketli Rekombinant DISC1 (598-785) Protein Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi

  1. Tohum 5x10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade.
  2. 5-10 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamına etiketli protein ekleyin ve 48-72 saat boyunca inkübe edilir.
  3. PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve ektraksiyonu gidermek5 dakika için% 0.04 'Tripan Mavisi ile ellular floresan.
  4. Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 'de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin.
  5. Lazer konfokal mikroskobu ile üretilen Z-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından rekombinant protein uygulanan eksojen alımı / işgali onaylayın. Ancak, endojen protein alımı esasen konak hücrenin protein işgali ile paralel olarak tespit edilemeyebilir, Z-yığın görüntüleri hala protein invaziv onaylayabilirsiniz.

Bizim örneğimizde rec de. DISC1 (598-785) * en azından kısmen acemi içinde çözünür DISC1 (598-854) konak hücre (Şekil 5A bakınız) tarafından ifade edilmiş protein GFP-etiketli. Rekombinant α-sinüklein işgali ama hiçbir işe için (Şekil 5B) gösterilmiştir. Resimler çekildibir Zeiss LSM 510 konfokal-ya da bir Zeiss mikroskobu Axiovision Apotome2.

Konsantre bir enjeksiyon ile bile hayvanın perfüzyon sonra tespit edilebilir enjeksiyon yeri etrafında protein yayılmasında Mpfc sonuçlara DISC1 (598-785) * işaretli (2.5 ug / ul arasında yaklaşık 4 ul), Bir rodamin filterset ile PBS pH 7.4 'de% 4 PFA. Bizim örneğimizde DISC1 (598-785) nöron ayrı bir numara tarafından alınır ve Z-yığın görüntüleme (Şekil 6) ile izlenebilir.

Genel olarak, burada kullanılan olanlardan daha sonra diğer proteinlerin enjeksiyon ister istemez hücre istilası yol açmaz. Işgali olayı protein niteliği üzerinde esasen bağlıdır, yine temiz bir arıtma daha fazla analiz için bir ön koşuldur.

7. Temsilcisi Sonuçlar

NLF hücrelerinden rekombinant FL DISC1-eGFP saflaştırılmış oluşan Aggresomes alıcı SH-SY5Y ce işgaldüşük verimlilik de lls (yaklaşık% 0.3 5) olarak konfokal mikroskobu (Şekil 3) ile ko tarafından görülebilir. Önceden bildirildiği gibi, DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış coli multimerler 4 pozitif kontrol (Şekil 5B) olarak paralel olarak kullanıldığı α-sinüklein ile benzer yaklaşık olarak% 20 5 (Şekil 5A) ve bir verimle eşit olarak hücre-invaziv oluşturmuştur. Etiketli rekombinant DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış multimerik proteini stereotaksi bir sıçan prefrontal korteks (; Pum, Bader, Huston, Korth, yayınlanmamış Şekil 6) enjekte edildiğinde coli da hücre-invaziv in vivo nöron oldu.

Şekil 1
Şekil 1. NLF nöroblastom hücrelerinde geçici FP-DISC1 (kırmızı) ifade. Kırmızı floresan aggresomes dete olabilir,hücre içindeki cted.

Şekil 2,
Şekil 2. Bir sükroz degrade arıtma sonrası DISC1 aggresomes MRFP etiketli saflaştırılmış.

Şekil 3
Şekil 3. Istila aggresomes Floresan resmi. MRFP etiketli flDISC1 aggresomes SH-SY5Y nöroblastom hücreleri ile saflaştırılmış ve inkübe edildi eksprese çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854). Etiketli aggresomes bir tutulum bir Lazer Tarama mikroskobu (Zeiss LSM 510) Z-yığın görüntüleme ile izlenir.

Şekil 4,
Şekil 4. Rec SEC-profili. S704 ve C704 tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) içeren DISC1 (598-785). Her iki değişken sıralanmıştır oligomerizasyonun bir bozulma ve yüksek moleküler ağırlıklı mult oluşumunu göstermekimers (kırmızı ok). Bu resim Leliveld ark yayın., Biyokimya 2009 değiştirilir.

Şekil 5,
Şekil 5. Invaziv DyLight-etiketli rekombinant DISC1 (598-785) Floresan Z-yığın resim. Çözünür GFP-DISC1 (598-854) ifade eden SH-SY5Y nöroblastoma hücre etiketli ile inkübe edildi, 5 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici protein. (A) Kırmızı agrega rec işgali gösterir. DISC1 (598-785) protein ve sarı noktalar agrega içine çözünür GFP-DISC1 (598-854) bir işe göstermektedir. (B) Rekombinant α-sinüklein (kırmızı) yaklaşık% 20 oranında bir sıklık ile işe alım olmadan hücreleri işgal etti. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6
Şekil 6. Immünofloresan resmienjekte etiketli, rekombinant DISC1 (598-785) proteini. Z-yığın görüntüleme rec varlığını teyit eder. Nöronal çekirdeklerin (Neun, yeşil) karşı bir antikor ile boyandı sıçan kortikal nöronlarda DISC1 (598-785) proteini.

Discussion

Bu çalışmada, bir transfekte edilmiş nöroblastoma hücre çizgisi, bunların hazırlanması ve bir rekombinant protein DISC1 tür etiketleme ve in vitro ve in vivo olarak alıcı hücrelerin hücre istilası deneylerde uygulama mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes saflaştırılması açıklanmıştır.

Yerli mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes arıtılması Lewy cismi benzeri yapılar ve büyük agrega 13, 14 yalıtmak için protokoller geliştirildi, fakat deterjan kullanımını önlemek için ve oluşabilecek hücre invazyonu yanlış pozitif riskini en aza indirmek için güncellenmiştir deterjan kolaylaştırılmış membran penetrasyonu nedeniyle.

Bir olası gelecek iyileşme daha fazla aggresomes tamamen ayrı kalan membranları ve hücre iskeleti ile sonikasyon ile aggresomes saflığını arttırmak için de olabilir. Artan genel saflık olarak, büyük aggresomes ma için kaydedilen toplam işgal olayların sayısınıy 5 artırılacak. Önerdiğimiz 3 fazlı sukroz sınırlı tanımı diğer protein türlerinden aggresomes için yeterli olup olmadığı test edilmelidir, bu anlamda protokol burada özetlenen bireysel optimizasyon için bir başlangıç ​​noktası olarak kabul edilmelidir. Saflaştırılmış aggresomes sakkaroz izleri önemli ölçüde genel verimi azaltmak etmedi ortadan kaldırmak için bizim eller, ek yıkama adımları (deterjansız) oldukça sağlam olduğunu kanıtladı.

Önceki bir yayında bu DISC1 bir oligomer montaj C-terminali 4 (Şekil 4) farklı multimerization etki bağlı olduğunu tanımlanmıştır. Biz, E., rekombinant çözünür ifade için bu parça seçtik coli ve sonraki ve Ni-NTA saflaştırılması. Onun multimerization izlemek ve α-sinüklein gibi tarif hücre-invaziv proteini ile hücre invazivlik karşılaştırmak için, biz floresan boya DyLight594 ile DISC1 (598-785) etiketli ve kıyaslaeşit olarak etiketlenmiş α-sinüklein bu ile hücre-invaziv. Rekombinant DISC1 parçasının hücre-invaziv ölçüde doğal, tam uzunlukta DISC1 aggresomes, muhtemelen daha küçük boyutlu ve daha yüksek bir saflık derecesi ile karşılaştırıldığında çıkarıldı. Yine, saflıkta hücre-invaziv belirleyici bir rol oynadığı görülmektedir.

Bizim örneğimizde invaziv aggresomes Birleştirilerek bir çözünür, yani hücre dağınık şeklinde ifade edildi hedef hücre hattı çözünür homolog protein işe. Bu Z-yığın görüntüleme yoluyla alıcı hücre sınırı içinde invaziv aggresomes ve rekombinant proteinlerin ko sağlar beri alıcı hücre hattı bir floresan proteini (örneğin GFP veya TÇ) ifadesi bir avantajdır.

Hücre-invaziv DISC1 aggresomes ve multimerik parçaları ifade ve E. arınmış coli DISC1, DI ilgili bir proteinin konformasyon hastalıkların tanımlayıcı bir özelliği olabilirSC1opathies 15.

Çekim Trouble:

Sukroz gradient saflaştırma sonrasında Düşük aggresome verim:

Bu protokol tanıtılan sukroz gradient eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes ile iyi çalışır. Diğer proteinlerden oluşan Aggresomes değişken boyutlarda olabilir, bu nedenle sakaroz konsantrasyonları diğer kullanıcılar tarafından optimize edilmesi gerekmektedir.

Rekombinant protein Yetersiz saflaştırılması:

Rekombinant protein arıtma işlemi herhangi bir bakteri kirletici maddeler de protokol sonraki adımda etiketlenir. Bulaşmayı önlemek için, SDS-PAGE ile protein çalıştırın ve rekombinant proteini Coomassie-Blue ile boyanarak saf, en az% 95 olduğunu onaylayın. Yüksek kalite ve verimi sağlamak için, her bir ayrı protokol protein için optimize edilmelidir.

Düşük etiketleme efRekombinant proteinlerin ficiency:

Serbest SH grupları içeren herhangi bir kontaminasyondan proteinin etkili etiketleme azalacaktır. Bu nedenle, kapsamlı diyaliz ve Ni-NTA bazlı saflaştırma zorunludur.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Düsseldorf Üniversitesi Tıp Fakültesi Forschungskommission bir hibe ile desteklenen CKVB için; Bu çalışma CK ve JPH, DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NÖRON-Eranet keşfet (BMBF 01EW1003) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093 Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
DMEM/F-12 Invitrogen 11320-033 Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user.
PBS Invitrogen 14190-250
Metafectene Biontex T020-1.0 Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol.
Ni-NTA agarose Qiagen 30210 The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well.
DNase I Roche 04716728001 There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Opti-MEM Invitrogen 31985-062 Serum-free medium works as well
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122 Supplement for SH-SY5Y and NLF medium
Non-essential-amino-acids (NEAA) Sigma-Aldrich M7145 Supplement for SH-SY5Y medium
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154 Toxic reagent
DyLight 594 Maleimide Thermo-Fisher Scientific 46608 Reduced cysteine reactive dye to form stable thi–ther bonds. Also available in other colors.
ProLong Gold with DAPI Invitrogen P36935 This antifade liquid mountant gave superior results in our hands.
Protease Inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution.
Synthetic a-synuclein Sigma S7820 Refold as described in text.
Table of specific reagents.
Precellys 24 Bertin Technologies 03119.200.RD000 We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol.
5301 Concentrator (speedvac) Eppendorf 5301 000.210 Only necessary if protein has to be concentrated.
LSM 510 and Axiovision Apotome2 Zeiss See manufacturers catalog Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events.
Cell culture plastic material Nunc 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here.
Table of specific material and equipment.
Number Buffer name content Comments
1. Bacterial growth medium 16 g/l Bacto Tryptone, 10 g/l Bacto Yeast extract, 5 g/l NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5mM MGSO4, 100 μg/ml carbencillin, 35 μg/ml chloramphenicol Grow bacteria to OD600: 0.6-0.8 induce expression with 1 mM IPTG.
2. Bacterial resuspension buffer 50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 μg/ml lysozyme, 20 mM MgCl2 and 400 U/50 ml DNase I Resupend bacterial pellet from 1 L overnight culture in 50 ml resuspension buffer.
3. Protein extraction buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME
4. Ni-NTA column wash buffer 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 8 M urea and 10 mM b-ME, 12 mM imidazole Modified extraction buffer with 12 mM imidazole added.
5. Ni-NTA column elution buffer 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA and 10 mM b -ME The elution buffer contains 10 mM b -ME, which is dialyzed later on.
6. PBS 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4, adjust to pH 7.4
7. Labeling buffer PBS containing 5 mM TCEP
Table of recipes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millar, J. K. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).
  2. St Clair, D. Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet. 336, 13-16 (1990).
  3. Leliveld, S. R. Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease. J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).
  4. Leliveld, S. R. Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C. Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).
  5. Ottis, P. Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes. Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).
  6. Meyer-Luehmann, M. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, 1781-1784 (2006).
  7. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).
  8. Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change. J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).
  9. Clavaguera, F. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).
  10. Desplats, P. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).
  11. Ren, P. H. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).
  12. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).
  13. Iwatsubo, T. Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease. Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).
  14. Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. Isolation of aggresomes and other large aggregates. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).
  15. Korth, C. DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1. Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).
Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).More

Bader, V., Ottis, P., Pum, M., Huston, J. P., Korth, C. Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species. J. Vis. Exp. (66), e4132, doi:10.3791/4132 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter