Summary

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Published: June 02, 2012
doi:

Summary

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso de<em> In vitro</em> Métodos para estudar a migração, a auto-renovação, e multipotency da crista neural.

Abstract

O embrionário da crista neural (NC) é uma população de células progenitoras multipotentes que origina na face dorsal do tubo neural, sofre uma transição epitelial para mesenquimal (TEM) e migra ao longo do embrião, dando origem a diversos tipos celulares 1-3. NC também tem a capacidade única de influenciar a diferenciação e maturação de órgãos-alvo 4-6. Quando explantado in vitro, células progenitoras de NC submetidos a auto-renovação, migrar e diferenciam-se em uma variedade de tipos de tecidos incluindo neurónios, células gliais, células musculares lisas, cartilagem e do osso.

Multipotency de NC foi descrita pela primeira vez a partir de explantes do tubo neural aviária 7-9. Em isolamento in vitro de células de NC facilita o estudo de NC dinâmica, incluindo a proliferação, migração e multipotency. Trabalho adicional nos sistemas de aves e de rato demonstraram que as células explantadas NC NC reter o seu potencial quando transplantadas de volta para o embrião 10-13. Como essas propriedades inerentes celulares são preservadas em progenitores explantadas NF, o ensaio de explante tubo neural fornece uma opção atrativa para o estudo da NC in vitro.

Para alcançar uma melhor compreensão da NC mamíferos, muitos métodos têm sido utilizados para isolar populações NC. NC-derivados progenitores podem ser cultivadas a partir de pós-migratórias locais em ambos o embrião e adulto para estudar a dinâmica dos progenitores pós-migratórias NC 11,14-20, no entanto isolamento de células progenitoras de NC como eles emigram a partir do tubo neural fornece preservação óptima de NC célula potencial e propriedades migratórias 13,21,22. Alguns protocolos empregar separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar uma população enriquecida para NC progenitores particulares 11,13,14,17. No entanto, quando se inicia com embriões na fase inicial, os números de células adequadas para as análises são difíceis de obter com FACS, complicando o isolamento de início NC populations a partir de embriões individuais. Aqui, descrevemos uma abordagem que não depende de FACS e resultados em uma população de aproximadamente 96% NC puro com base em uma Wnt1-Cre repórter linhagem ativado 23.

O método aqui apresentado é uma adaptação de protocolos otimizados para a cultura do rato NC 11,13. As vantagens deste protocolo, em relação aos métodos anteriores são de que 1) as células não são cultivadas em uma camada alimentadora, 2) FACS não é necessário para obter uma população relativamente puro NC, 3) células premigratory NF são isolados e 4) os resultados são facilmente quantificado. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de NC a partir de qualquer modelo de rato mutante, facilitando o estudo das características NF com diferentes manipulações genéticas. A limitação desta abordagem é que o NF é removido a partir do contexto do embrião, o que é conhecido para influenciar a sobrevivência, a migração ea diferenciação do NC 2,24-28.

Protocol

1. Placas de Preparação Use técnica estéril em todos os momentos. Preparar fibronectina (FN) por diluição de 100 ul de estoque humano FN plasma para um volume final de 3,3 mL em PBS de Dulbecco (DPBS). Concentração final é de 30 ug / mL e esta pode ser armazenada a 4 ° C durante 1 semana. Cobrir parte inferior de cada poço de uma cultura de tecidos estéril quatro placa bem com uma solução de FN e deixar assentar durante 15 minutos. Certifique-se de toda a superfície é cober…

Discussion

Atenção especial deve ser dada à fase de desenvolvimento do embrião para garantir o sucesso desta abordagem. Contando somitos de embriões de rato é fundamental tanto para a fase correspondente embriões dentro de uma maca e determinar as regiões corretas do tubo neural para o isolamento. Uma variação de um ou dois sómitos entre os embriões está dentro de uma gama razoável de tempo de desenvolvimento, dependendo da resolução da experiência realizada. Um embrião entre 9 e 9,5 dpc terá entre 17 e 25 somit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós gostaríamos de agradecer Marc Wozniak para a assistência de vídeo. Gostaríamos também de agradecer Sean Morrison na UT Southwestern para o protocolo original para a cultura de células de ratos NC. Este trabalho foi apoiado Vanderbilt University Medical Center Programa de Apoio Acadêmico e por concessões do NIH (HD36720 e HD036720 11S109-) eo 11GRNT7690040 AHA para PAL, bolsas predoctoral da AHA (0615209B) e NIH (NS065604) para NAM, e ERP foi apoiada por um treinamento NIH concessão T32HD007502.

Materials

Reagent Company Catalogue number Comments
DMEM (low glucose) Gibco/Invitrogen 11885  
Neurobasal Medium Gibco 21103  
BSA Sigma A3912-10G  
dPBS Gibco 14190-144  
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin Gibco 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid Sigma R2625 Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol Sigma D-5637  
N2 supplement Gibco 17502-048  
B27 supplement Gibco 17504-044  
Steriflip 0.22 μm filters Millipore SCGP00525  
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140122  
0.20 μm filters Corning 431219  
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604  
Four well plates Thermo Fisher Scientific 176740  
Collagenase/Dispase Roche 269 638 Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles
(29½ gage)
Becton Dickson 309306  
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg    
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg    
Forceps #5 Fine Science Tools   For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200  

References

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. . The neural crest. , (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -. P. . Neural crest induction and differentiation. , (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. , 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).

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Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

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