Isolering av embryonale neural crest fra nevralrøret forenkler bruken av<em> In vitro</em> Metoder for å studere migrasjon, selvfornyelse, og multipotency av neural crest.
Den embryonale neural crest (NC) er en multipotent stamfar befolkning som stammer ved dorsal del av nevralrøret, gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og vandrer hele embryoet, som gir opphav til ulike celletyper 1-3. NC har også en unik evne til å påvirke differensiering og modning av målorganer 4-6. Når eksplantert in vitro, NC stamfedre gjennomgå selvfornyelse, vandrer og skille ut en rekke vevstyper inkludert nerveceller og gliaceller, glatte muskelceller, brusk og bein.
NC multipotency ble først beskrevet fra explants av luftfarten nevralrøret 7-9. In vitro isolering av NC celler letter studiet av NC dynamikk, inkludert spredning, migrasjon, og multipotency. Videre arbeid i luftfarten og rotte systemer vist at eksplanterte NC cellene beholder sin NC potensial når transplantert tilbake til fosteret 10-13. Fordi disse iboende cellulære egenskapene er bevart i eksplanterte NC stamfedre, gir nevralrøret eksplantering analysen et attraktivt alternativ for å studere NC in vitro.
For å oppnå en bedre forståelse av pattedyr NC har mange metoder blitt ansatt for å isolere NC populasjoner. NC-deriverte stamfedre kan dyrkes fra post-trekkende steder i både embryo og voksne til å studere dynamikken i post-trekkende NC stamfedre 11,14-20 imidlertid isolering av NC stamfedre som de emigrere fra nevralrøret gir optimal bevaring av NC celle potensiale og trekkende egenskaper 13,21,22. Enkelte protokoller benytter fluorescens aktivert celle sortering (FACS) å isolere en NC befolkning beriket for bestemte stamfedre 11,13,14,17. Men når du starter med tidlig stadium embryoer, celle tall tilstrekkelige for analyser er vanskelig å få med FACS, kompliserer isolering av tidlig NC populations fra individuelle embryo. Her beskriver vi en tilnærming som ikke er avhengig FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkningen basert på en Wnt1-Cre aktivert avstamning reporter 23.
Metoden som presenteres her er tilpasset fra protokoller optimalisert for kulturen i rotte NC 11,13. Fordelene med denne protokollen i forhold til tidligere metoder er at 1) cellene ikke er dyrket på en mater lag, 2) FACS er ikke påkrevd for å oppnå en relativt ren NC befolkning, 3) premigratory NC cellene er isolert og 4) resultatene er lett kvantifisert. Videre kan denne protokollen brukes til isolering av NC fra noen mutant mus modell, tilrettelegge studiet av NC egenskaper med ulike genetiske manipulasjoner. Begrensningen av denne tilnærmingen er at NC er fjernet fra rammen av embryo, som er kjent for å påvirke overlevelse, migrasjon og differensiering av NC 2,24-28.
Nøye oppmerksomhet bør rettes mot utviklingsstadiet av embryo for å sikre suksess for denne tilnærmingen. Telle somites av tidlige mus embryoer er kritisk både for scene matching embryo innenfor et kull og bestemme de riktige delene av nevralrøret for isolasjon. En variant av en eller to somites mellom embryoer er innen rimelig rekkevidde av utviklingsmessige timing, avhengig av oppløsningen av forsøket gjennomført. Et embryo mellom 9 og 9,5 DPC vil ha mellom 17 og 25 somites. Hvis fosteret har mer enn 25 somit…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Marc Wozniak for video hjelp. Vi ønsker også å erkjenne Sean Morrison ved UT Southwestern for den opprinnelige protokollen for dyrkning rotte NC celler. Dette arbeidet ble støttet Vanderbilt University Medical Center Academic Program Support og med tilskudd fra NIH (HD36720 og HD036720-11S109) og AHA 11GRNT7690040 til PAL, predoctoral stipend fra AHA (0615209B) og NIH (NS065604) til NAM, og ERP var støttet av en NIH trening stipend T32HD007502.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
BSA | Sigma | A3912-10G | |
dPBS | Gibco | 14190-144 | |
IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |