Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr
Summary
Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung von<em> In-vitro-</em> Methoden zur Untersuchung von Migration, Selbsterneuerung und Multipotenz der Neuralleiste.
Abstract
Die embryonalen Neuralleiste (NC) ist ein multipotenten Vorläufer-Population, die an der dorsalen Seite des Neuralrohrs stammt, erfährt eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) und wandert während des Embryos, was zu diversen Zelltypen 1-3. NC hat auch die einzigartige Fähigkeit, die Differenzierung und Reifung von Zielorganen 6.4 zu beeinflussen. Wenn es in vitro explantiert, NC Vorläuferzellen Selbsterneuerung durchlaufen, Migration und Differenzierung in eine Vielzahl von Gewebetypen einschließlich Neuronen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Knorpel und Knochen.
NC Multipotenz wurde zum ersten Mal aus Explantaten der Vogelgrippe Neuralrohr 7-9 beschrieben. In-vitro-Isolierung von NC-Zellen erleichtert die Untersuchung der Dynamik NC einschließlich Proliferation, Migration, und Multipotenz. Weitere Arbeiten in den Vogel-und Ratten-Systemen gezeigt, dass explantierten NC-Zellen ihre NC-Potenzial zu behalten, wenn wieder in den Embryo verpflanzt 10-13. Da diese inhärenten zellulären Eigenschaften in explantierten NC Vorfahren bewahrt werden, bietet das Neuralrohr Explantat Assay eine attraktive Option für das Studium der NC in vitro.
Um ein besseres Verständnis der Säuger NC zu erreichen, wurden viele Verfahren verwendet worden, um NC-Populationen zu isolieren. NC-abgeleitete Vorläuferzellen aus der Post-wandernde Standorten können sowohl im Embryo und Erwachsenen, die Dynamik des Post-NC wandernden Vorläuferzellen 11,14-20 studieren kultiviert werden, jedoch Isolierung von NC-Vorläuferzellen, wie sie aus dem Neuralrohr auswandern sorgt für eine optimale Erhaltung der NC-Zellen-Potenzial und wandernde Eigenschaften 13,21,22. Einige Protokolle verwenden fluorescence activated cell sorting (FACS), einen NC Bevölkerung für bestimmte Vorläuferzellen 11,13,14,17 bereichert zu isolieren. Allerdings, wenn beginnend mit frühen Embryonen, sind ausreichende Zellzahlen für die Analysen nur schwer mit FACS erhalten, erschwert die Isolierung des frühen NC populations aus einzelnen Embryonen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der nicht auf FACS Ergebnisse angewiesen ist und in einer etwa 96% reines NC Bevölkerung auf einem Wnt1-Cre-Reporter aktivierte Linie 23 basiert.
Das hier vorgestellte Verfahren ist von Protokollen für die Kultur von Ratten-NC 11,13 optimiert angepasst. Die Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Verfahren sind, daß 1) die Zellen nicht auf einer Feeder-Schicht, 2 gezüchtet) FACS ist nicht erforderlich, eine relativ reine NC Bevölkerung, 3 zu erhalten) premigratory NC Zellen isoliert und 4) Ergebnisse sind leicht quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die Isolierung von NC von jedem mutante Maus-Modell verwendet, die die Untersuchung der NC-Eigenschaften mit unterschiedlichen genetischen Manipulationen. Die Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die NC aus dem Kontext des Embryos, von denen bekannt ist, um das Überleben, Migration und Differenzierung der NC 2,24-28 zu beeinflussen, wird entfernt.
Protocol
Discussion
Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Entwicklungsstufe des Embryos zu zahlen, um den Erfolg dieses Ansatzes zu gewährleisten. Zählen von Somiten frühe Mausembryonen ist sowohl für die Bühne passend Embryonen innerhalb eines Wurfes und der Bestimmung der richtigen Regionen des Neuralrohrs für die Isolierung von entscheidender Bedeutung. Eine Variation von ein oder zwei Somiten zwischen Embryonen ist innerhalb einer angemessenen Palette von der zeitlichen Entwicklung, abhängig von der Auflösung des Experiments …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Marc Wozniak für Video-Hilfe anzuerkennen. Wir möchten auch Sean Morrison an der UT Southwestern anerkennen für das Original-Protokoll zur Kultivierung von Ratten-NC-Zellen. Diese Arbeit wurde Vanderbilt University Medical Center Academic Program-Support unterstützt und durch Zuschüsse der NIH (HD36720 und HD036720-11S109) und der AHA 11GRNT7690040 zu PAL, Chemiefonds Stipendien von der AHA (0615209B) und NIH (NS065604) zu NAM und ERP war unterstützt durch ein NIH Ausbildungsförderung T32HD007502.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
| Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
| Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |
References
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