Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

doi: 10.3791/4134 Published: June 2, 2012

Summary

العزلة من قمة العصبية الجنينية من الأنبوب العصبي يسهل استخدام

Abstract

والجنينية العرف العصبي (NC) هو عدد السكان سلف multipotent الذي ينشأ في الجانب الظهري في الأنبوب العصبي، يخضع 1 الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وتنتقل في مختلف أنحاء جنين، مما أدى إلى مختلف أنواع الخلايا 1-3. NC أيضا لديه قدرة فريدة على التأثير على التمايز والنضج من الأعضاء المستهدفة 4-6. عندما explanted في المختبر، الأسلاف NC الخضوع الذاتي تجديد، والهجرة تفرق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة بما في ذلك الخلايا العصبية، والدبق، وخلايا العضلات الملساء، والغضاريف والعظام.

وكان أول وصف NC multipotency من explants من الأنبوب العصبي الطيور 7-9. في عزلة في المختبر من خلايا NC يسهل دراسة ديناميات NC بما في ذلك انتشار الأسلحة النووية، والهجرة، وmultipotency. مزيد من العمل في أنظمة الطيور والفئران أظهرت أن الخلايا explanted NC الاحتفاظ إمكاناتهم NC عندما زرعها مرة أخرى في جنين 10-13. لأن الحفاظ على هذه الخصائص الكامنة الخلوية في الأسلاف NC explanted، ويزدرع الأنبوب العصبي فحص يوفر خيارا جذابا لدراسة نورث كارولاينا في المختبر.

من أجل التوصل إلى فهم أفضل للNC الثدييات، وقد استخدمت العديد من الأساليب لعزل سكان نورث كارولاينا. يمكن زرعها NC المستمدة من الأسلاف من ما بعد الهجرة مواقع في كل من جنين وتعليم الكبار لدراسة ديناميات الأسلاف نورث كارولاينا في مرحلة ما بعد الهجرة 11،14-20، ولكن بمعزل عن الأسلاف نورث كارولاينا حيث يهاجر من الأنبوب العصبي يوفر الحفاظ الأمثل لل NC الخلية المحتملة، والخصائص الكثيرة 13،21،22. بعض البروتوكولات توظيف مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) لعزل السكان NC المخصب لأسلاف خاصة 11،13،14،17. ومع ذلك، عندما تبدأ الأجنة مرحلة مبكرة، وأرقام الخلية كافية لتحليل ويصعب الحصول على مع نظام مراقبة الأصول الميدانية، مما يعقد من عزلة populatio نورث كارولاينا في وقت مبكرنانوثانية من أجنة الفردية. هنا، نحن تصف النهج الذي لا يعتمد على نظام مراقبة الأصول الميدانية والنتائج في عدد السكان ما يقرب من 96٪ NC محض على أساس مراسل Wnt1، لجنة المساواة العرقية نسب المنشط 23.

ويتم تكييف الطريقة المعروضة هنا من البروتوكولات الأمثل لثقافة NC الفئران 11،13. من مزايا هذا البروتوكول بالمقارنة مع الطرق السابقة هي أن 1) لا نمت الخلايا على طبقة التغذية، 2) نظام مراقبة الأصول الميدانية ليست مطلوبة للحصول على سكان NC نقي نسبيا، 3) يتم عزل الخلايا premigratory NC و 4) النتائج بسهولة كميا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل NC من أي نموذج الفأر الطافر، وتسهيل دراسة الخصائص NC مع التلاعب الجيني مختلفة. الحد من هذا النهج هو أن تتم إزالة NC من سياق جنين، والذي يعرف للتأثير على البقاء على قيد الحياة، والهجرة، والتمايز في نورث كارولاينا 2،24-28.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد لوحات

  1. استخدام تقنية معقمة في كل الأوقات.
  2. إعداد فبرونيكتين (الجبهة الوطنية) من خلال تمييع 100 ميكرولتر من الإنسان مخزون FN البلازما إلى حجم نهائي قدره 3.3 مل في برنامج تلفزيوني في Dulbecco (dPBS). التركيز النهائي هو 30 ميكروغرام / مل ويمكن تخزين هذا في درجة مئوية 4 ل 1 الاسبوع.
  3. تغطية الجزء السفلي من كل بئر من لوحة النسيج عقيمة 4 ثقافة بشكل جيد مع حل الجبهة الوطنية والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة. تأكد من يتم تغطية كامل السطح. جعل وسائل الإعلام خلال هذه الفترة (الخطوات 2 و 3).
  4. إزالة الجبهة الوطنية حل والسماح لوحات لتجف. شطف الآبار بلطف مع 500 DMEM ميكرولتر، وإزالة DMEM، وإضافة 500 ميكرولتر من التجديد الذاتي (ريال) المتوسط ​​(انظر أدناه). احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. إكمال هذه ساعة واحدة تقريبا قبل تشريح بحيث لوحات وسوف تكون جافة قبل الاستخدام.

2. يستعد ريال متوسطة

  1. لثقافة NC المبهم والجذع10 من الأجنة (حوالي لتر واحد، اعتمادا على خلفية وراثية من خط الماوس)، وإعداد 25 مل من وسط ريال. الجمع بين 12.5 مل منخفض DMEM الجلوكوز، 7.5 مل متوسطة Neurobasal، 25 حمض الريتينويك ميكرولتر (117 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 25 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (50 ملي تركيز النهائي). تخلط جيدا.
  2. إضافة 3.75 مل استخراج أجنة الدجاج، 250 ميكرولتر N الملحق ملح 500 ميكرولتر ملحق B27 و 250 ميكرولتر البنسلين، الستربتومايسين (تركيز النهائي 1٪). تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
  3. إضافة 10 IGF1 عقيمة ميكروليتر (20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 20 ميكرولتر bFGF عقيم (20 ميكروغرام / مل تركيز نهائي). مزيج من قلب. تخزن في درجة مئوية 4

3. إعداد متوسطة غسيل

  1. لنحو 10 الأجنة تحضير 50 ​​مل من المتوسط ​​غسيل. الجمع بين 50 ملغ جيش صرب البوسنة مع 35 مل DMEM انخفاض الجلوكوز، 15 مل متوسطة Neurobasal، و 500 ميكرولتر البنسلين، الستربتومايسين (1٪ تركيز النهائي). معقم فلتر مع 0.22ميكرون فلتر.

4. إعداد كولاجيناز / dispase

  1. إضافة 50 ميكرولتر من dPBS مل 100 ملغ / مل كولاجيناز / dispase إلى 5. تخلط جيدا.
  2. مرشح المحاقن مع 0.2 ميكرون تصفية وإضافة 1.5 مل في كل من ثلاثة آبار من 12 لوحة جيدا. ماصة غسل ما يقرب من 1 مل المتوسطة في الآبار المتبقية. لوحة تخزين كامل على الجليد حتى على استعداد لهضم الأنسجة تشريح.
  3. قطع نصائح من طرف ماصة P20 و P1000 مرشح بشفرة حلاقة معقمة. قص أسفل حافة مشطوف من غيض. وسيتم استخدام القطع قبالة P1000 لنقل الجنين كامل في حين سيتم استخدام P20 لنقل قطع من الأنسجة المعزولة.

5. عزل المبهم والأنبوبة العصبية الجذع من أجنة DPC 9.5

  1. في حالات الحمل توقيتها، وتعتبر السدود مع المكونات المهبلية 0،5 DPC ظهرا من صباح اليوم لوحظ المكونات. تضحية وإزالة الرحم في DPC 9.5.
  2. إزالة الساقط من رحم وبلطف صemove الجنين من الساقط. شهدت مرة واحدة مع هذا البروتوكول، عزل 3-4 9.5 الأجنة DPC في وقت واحد في dPBS العقيمة. استخدام تقنية معقمة وأدوات تشريح للتعقيم. يمكن تعقيم أدوات التعقيم بواسطة جهاز الأوتوكليف الحرارة، أو عن طريق حضانة في الايثانول.
  3. لNC المبهمي الأمامي: استخدام إبر الأنسولين، وقطع الأنبوب العصبي في اللوحاء في منتصف أذني. قطع مرة أخرى على حافة الخلفي من الجسيدة 4 ال. تقليم الأنسجة بطني إلى الأنبوب العصبي لإزالة الأقواس البلعومية والقلب.
  4. لNC الجذع: استخدام إبر الأنسولين، وإزالة جزء من الأنبوب العصبي بين somites 16-22 (أو الجسيدة مشاركة إذا الأجنة تنمويا في وقت سابق من مرحلة الجسيدة 22).
  5. ابقاء الكيس المحي وأي نوع من الأنسجة الجنينية المتبقية لالتنميط الجيني.

6. إزالة غير الأديم الظاهر العصبي والأديم المتوسط

  1. وضع الأنبوب العصبي التي تحتوي على شرائح في كولاجيناز / dispase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقةق. يغسل فورا في المتوسط ​​غسيل.
  2. عودة إلى الأنسجة dPBS العقيمة. استخدام إبر الأنسولين العقيمة، وإزالة بلطف الأديم الظاهر غير عصبية من الأنسجة وفصل و somites بعيدا عن الأنبوب العصبي. ويمكن إزالة الأجزاء آخر ما تبقى من الطبقة الجرثومية الوسطى من الأنسجة الجسيدة بواسطة triturating بلطف باستخدام قطع أسفل P20 طرف. كن حذرا حتى لا تضر الأنبوب العصبي. مراقبة ذلك عن كثب خلال سحن.
  3. وضع أنبوب معزولة العصبية من خلال غسل الثانية والثالثة 30 ثانية من غسل المتوسطة.
  4. يغسل مرة واحدة في وسط ريال، ووضع أنبوب معزولة العصبية في مركز بئر FN المغلفة التي أعدت من قبل (الخطوة 1.3). ترطيب الغرفة نقص الأكسجة مع طبق من الماء المعقم. وضع طبق في غرفة نقص الأكسجة وتدفق الغاز مع غرفة مختلطة إلى 3٪ O 2 (استخدام دبابة تحتوي على خليط من 1٪ O 6٪ CO 93٪ N 2).
  5. تعامل دائما الغرفة بعناية فائقة لضمان ثاexplants تي هي دون عائق، والبقاء في مركز للآبار.
  6. احتضان عند 37 درجة مئوية. ويظهر ملخص للخطوات 5-6 في الشكل 1.

7. إزالة الأنبوب العصبي

  1. بعد 24 ساعة من الحضانة، وإزالة الأنبوب العصبي بواسطة إغاظة بلطف حافة الأنبوب العصبي بعيدا عن الخلايا المهاجرة باستخدام إبرة الأنسولين العقيمة. إزالة والتخلص من الأنبوب العصبي من المتوسط ​​باستخدام قطع P20 العقيمة كما في الخطوة 6.2 و استبدال المتوسطة مع المتوسطة ريال الطازجة (الشكل 2). هو الأكثر بسهولة القيام بذلك باستخدام مجهر مقلوب.

8. ممثل النتائج

بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأوكسجين، والخلايا NC هاجروا بعيدا عن الأنبوب العصبي في عدد سكانها ما يقرب من محض (الشكل 3A). في بعض الأحيان، وهذا اقل مما الثقافات المثالي لا تسفر عن الامتداد القوي. على سبيل المثال، فمن الممكن أن بعد 24 ساعة تيسيكون قد كرة لولبية كان الأنبوب العصبي حتى على نفسها، ونورث كارولاينا لن تهاجر بعيدا عن الأنبوب العصبي (الشكل 3B). في بعض الأحيان فإن الأنبوب العصبي لا نعلق على لوحات والمغلفة فبرونيكتين.

في تجربتنا، يمكن دون المستوى الأمثل NC الهجرة أو مشاكل مع المرفقات في الأنبوب العصبي تتأثر سلبا ظروف normoxia أو تركيز فبرونيكتين، على التوالي. ولا بد من تعديل النشاط الأنزيمي من كولاجيناز / dispase يختلف قليلا عن طريق دفعة والوقت مناسب الهضم، ومع ذلك، لا هضم الأنسجة وقتا أطول من 15 دقيقة. وسوف Overdigestion في الأنبوب العصبي التي تحتوي على نسج في كولاجيناز / dispase يؤدي أيضا إلى الامتداد ناقص. إذا لم يتم الأنسجة الجسيدة إزالتها بسهولة من الأنبوب العصبي بعد حضانة في كولاجيناز / dispase، يمكن تحضين الأنبوب العصبي لمدة تزيد عن عشر دقائق. في بعض الأحيان فإن الأنبوب العصبي لا نعلق على الركيزة. إذا كان هذا هو الحال، انقر نقرا مزدوجا التحقق من fibronecتركيز القصدير وظروف نقص الأكسجة.

بينما يمكن استخدام الظروف normoxic إلى ثقافة البرية من نوع نورث كارولاينا، وظروف نقص الأوكسجين بشكل وثيق في بيئة تحاكي فيفو 29،30. في تجربتنا، وأصبحت الظروف الحرجة عندما ميتة زراعة متحولة NC. على سبيل المثال، كان NC جذع عندما تم زرعها Foxd3 متحولة NC في ظروف normoxic، وهو ثمرة خلية تقلص إلى حد كبير بالمقارنة مع الضوابط. تمت إزالة هذا التفاوت في حجم ثمرة عندما تم زرعها في explants في ظروف نقص الأوكسجين (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، كان عدد كاسباس إيجابية الخلايا عندما تم زرعها من النوع البري explants الأنبوب العصبي في normoxia، ثم أن من أكبر explants مماثل زرعها في نقص الأكسجة (لا تظهر البيانات). من خلال الحفاظ على كل ثقافة نورث كارولاينا في نقص الأكسجين، ويمكن بسهولة أن يتم إجراء مقارنات بين ديناميات سيطرة وثقافات متحولة.

الشكل 1
> الشكل 1. التخطيطي بشكل عام من العزلة NC. A) تشريح المناطق ذات الاهتمام من الجنين. B) chester ملخص الأنبوب العصبي في كولاجيناز / dispase لمدة عشر دقائق (لا تتجاوز 15 دقيقة). C) في غسل الغسيل المتوسطة. D) تشريح بعيدا في الأديم الظاهر غير العصبية والأديم المتوسط. EF) غسل مرتين في المتوسط ​​غسيل. G) لوحة في المتوسط ​​تجديد الذات. احتضان في 37 درجة مئوية في 3٪ O 2 ظروف نقص الأوكسجين.

الشكل 2
الشكل 2. إزالة شكل خطوات من الأنبوب العصبي من ازدراع. ويجب إزالة الأنبوب العصبي بعد 24-48 ساعة لمنع التلوث مع المنظمات غير NC الخلايا. أ) لاحظ الحدود بين الأنبوب العصبي، وثمرة NC (الخط المتصل). ب) قطع على طول حافة الأنبوب العصبي مع إبرة الأنسولين. C) تجاهل الأنبوب العصبي واستبدال المتوسطة مع الطازجة النفس المتوسطة تجديد. خط متقطع يشير مدى ما آل إليه. الاختصار: NT، الأنبوب العصبي.

> الشكل (3)
الشكل 3. أمثلة من نتائج ممثل. A) ثمرة يزدرع النموذجية بعد حضانة 24 ساعة في المتوسط ​​تجديد النفس في ظروف نقص الأوكسجين (خط متقطع يشير مدى ما آل إليه). B) مكبر نظرا لنمو NC بعد 48 ساعة في الثقافة. ج) الثقافة أقل مثالية مع محصول ثمرة منخفضة. تم زرعها ألف وجيم في ظل نفس الظروف. الصور تظهر مدى متانة الطبيعية في الثقافة. يمكن أن تتأثر بذلك عن طريق كفاءة من العزلة الأنبوب العصبي، وتركيز الجبهة الوطنية، وظروف نقص الأوكسجين، والوقت في كولاجيناز / dispase الهضم.

الشكل 4
الشكل 4. في التحليلات المختبرية للثقافات يزدرع NC normoxia في مقابل نقص الأكسجة. السيطرة (نوع البرية) خلايا NC هاجروا من explants الأنبوب العصبي بعد 48 ساعة في ظروف ثقافة normoxic. في المقابل، Foxd3 متحولةقد تقلص إلى حد كبير NC الامتداد خلية في normoxia (حواف حمراء علامة الخطوط العريضة للالامتداد NC). نما Foxd3 متحولة explants NC عندما كانت تزرع explants مشابه في ظل ظروف نقص الأوكسجين، نسبيا لضوابط، مما يسمح للتحليلات لاحقة. علما أن هذا السلوك يرتبط بشكل جيد مع سلوك Foxd3 متحولة NC في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وينبغي إيلاء الاهتمام الدقيق لمرحلة التطوير من الجنين لضمان نجاح هذا النهج. عد somites من أجنة الفئران في وقت مبكر أمر بالغ الأهمية سواء بالنسبة للمرحلة مطابقة الأجنة داخل القمامة وتحديد المناطق الصحيح من الأنبوب العصبي للعزلة. وهناك تباين في واحد أو اثنين somites بين الأجنة داخل نطاق معقول من توقيت التنموية، وهذا يتوقف على قرار من التجربة التي أجريت. وسوف جنين بين 9 و 9.5 DPC ما بين 17 و somites 25. إذا كان الجنين لديه أكثر من 25 somites، وتقدم المزيد من نورث كارولاينا في وقت التنموية، والامتداد NC ستكون أقل قوة في الثقافة. انطلاق الأجنة على أساس عدد الجسيدة يسهل الدقة في التجارب عندما مرحلة التطوير من الجنين، وبالتالي نورث كارولاينا، ويمكن أن يؤثر على نتائج هذه التجارب. في جنين DPC 9.5، في نورث كارولاينا المبهمي يهاجر من الأنبوب العصبية الظهرية في حدود الأمامي، الخلفي تعريف: من اللوحاء منتصف أذني إلى الجسيدة 7.وبالمثل، NC جذع يهاجر من الأنبوب العصبي عند مستويات الجسيدة 8 إلى الجسيدة 24. إلى عزل السكان متميزة من الأسلاف نورث كارولاينا على النحو المبين في هذا البروتوكول، معزولة منفصلة مناطق فرعية داخل كل من هذه المجالات. فإن المنطقة في الأنبوب العصبي المستخدمة تتفاوت وفقا لتصميم التجربة والمنطقة الأمامية-الخلفي من نورث كارولاينا التي تجري دراستها.

ووصف الأوضاع ثقافة أعلاه، بما في ذلك على المديين المتوسط ​​وشروط الحضانة، ومصممة خصيصا لثقافة NC الفئران. استخدم لأول مرة مماثل ريال المتوسطة للثقافة NC الفئران 11. في أيدينا، وهذا المتوسط ​​الفئران، مع إضافة متوسطة Neurobasal، ينتج ثمرة قوية من الأسلاف NC الفئران. وعلاوة على ذلك، على عكس الخلايا السابقة استزراع العمل NC الطيور، طبقة المغذية لا لزوم لها ثقافة NC الثدييات باستخدام هذا الأسلوب 11،13،21،22. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات بالتفصيل كل من الطيور والثدييات ثقافة نورث كارولاينا في conditi normoxic إضافات 9،22، ونحن 23 (الشكل 4)، جنبا إلى جنب مع الآخرين في هذا المجال 20، وقد وجدت أن زراعة خلايا الفئران نورث كارولاينا في ظروف نقص الأوكسجين كما هو موضح هنا بقاء الإيدز بشكل كبير، وتجديد الذات، ربما لأن نقص الأكسجة بشكل وثيق يقلد مستويات الاوكسجين الفسيولوجية داخل الجنين 20،29،30.

تقييم للتعبير عن المؤشرات الجزيئية يسهل إلى حد كبير في تحديد الخلايا نورث كارولاينا ومشتقاتها المختلفة. وتشمل هذه تعبير عن Foxd3، P75، وSox10 للخلايا الجذعية NC. علامات NC متباينة تشمل العضلات الملساء ألفا الأكتين (SMA) لmyofibroblasts، الغروية بروتين لييفي الحمضية (GFAP) ل، الدبقية صغر المرتبطة عامل النسخ (MITF) لالصباغية، وتويولين بيتا-III، بروتين منتج الجين 9.5 (PGP9.5 )، وperipherin عن الخلايا العصبية. ويمكن استخدام هذه العلامات لتحديد كفاءة ازدراع والتفريق بين الأسلاف NC.

محتوى "> وبمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن استخدام NC مثقف في مجموعة متنوعة من فحوصات بما في ذلك تقدير حجم انتشار الأسلحة النووية، موت الخلايا، وديناميات الهجرة، ووضع / أو تمييز. NC يمكن أيضا أن يكون مثقف clonally للتحقيق الذات أو تجديد multipotency من تتم إزالة فرد الأسلاف NC 23. بعد الأنبوب العصبي من الثقافات، وفصل الخلايا NC في 100 ميكروليتر التربسين-EDTA (0.25٪) لمدة 5 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية. تطفئوا التربسين-EDTA في المتوسط ​​غسل الزائد (8-10 MLS) وذلك بإضافة 800 ميكروليتر لكل بئر، ونقل إلى فرد الأنابيب التي تحتوي على 15 مل المتوسطة غسيل. منبذة بلطف خلايا ب 150 XG لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف وresuspend بيليه خلية في 1 مل المتوسطة ريال. عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ولهم في لوحة ويمكن كثافة من 25 خلية / سم 2. هذه المستعمرات passaged متسلسل لفحص الذاتي تجديد. multipotency لفحص، والحفاظ على الخلايا NC في كثافة نسيلي في وسط ريال سعودي لمدة 6 أيام ومن ثم التبديل إلى تمايزالمتوسطة (10 نانوغرام / مل و 1٪ bFGF استخراج الجنين فرخ). ثقافة الخلايا في التمايز المتوسطة تحت نقص الأكسجين لمدة 8 أيام قبل تحليل تكوين مستعمرة مع المؤشرات الجزيئية على النحو الوارد أعلاه 11.

في الختام، هذه طريقة لعزل خلايا NC من أجنة الفئران تنتج تغذية ثقافة ملتصقة خالية من الخلايا NC premigratory من دون استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية. ويمكن بسهولة تحليل التجارب باستخدام هذه الخلايا يكون كميا. في حين أن هذا الأسلوب واضح ومباشر وتطبيقاتها لدراسة الخصائص من نورث كارولاينا، والهجرة النفس التجديد والتمايز، واسعة جدا. وعلاوة على ذلك، وعزل NC من أجنة الفئران المعدلة وراثيا يسمح للدراسة مباشرة لجينات معينة ومسارات في سياق الهجرة نورث كارولاينا، والبقاء على قيد الحياة، و / أو تمييز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

نود أن نعترف مارك زنياك للحصول على المساعدة فيديو. ونود أيضا أن نعترف شون موريسون في جنوب غرب التحرير للبروتوكول الأصلي لزراعة خلايا الفئران نورث كارولاينا. وأيد هذا العمل فاندربيلت المركز الطبي لجامعة لدعم البرنامج الأكاديمي، وكان من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HD36720 وHD036720-11S109) و11GRNT7690040 AHA على بال، والزمالات predoctoral من AHA (0615209B)، والمعاهد الوطنية للصحة (NS065604) لحركة عدم الانحياز، وتخطيط موارد المؤسسات بدعم من T32HD007502 تدريب منحة المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 μm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 μm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).More

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter