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Neuroscience

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

doi: 10.3791/4134 Published: June 2, 2012

Summary

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung von

Abstract

Die embryonalen Neuralleiste (NC) ist ein multipotenten Vorläufer-Population, die an der dorsalen Seite des Neuralrohrs stammt, erfährt eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) und wandert während des Embryos, was zu diversen Zelltypen 1-3. NC hat auch die einzigartige Fähigkeit, die Differenzierung und Reifung von Zielorganen 6.4 zu beeinflussen. Wenn es in vitro explantiert, NC Vorläuferzellen Selbsterneuerung durchlaufen, Migration und Differenzierung in eine Vielzahl von Gewebetypen einschließlich Neuronen, Gliazellen, glatten Muskelzellen, Knorpel und Knochen.

NC Multipotenz wurde zum ersten Mal aus Explantaten der Vogelgrippe Neuralrohr 7-9 beschrieben. In-vitro-Isolierung von NC-Zellen erleichtert die Untersuchung der Dynamik NC einschließlich Proliferation, Migration, und Multipotenz. Weitere Arbeiten in den Vogel-und Ratten-Systemen gezeigt, dass explantierten NC-Zellen ihre NC-Potenzial zu behalten, wenn wieder in den Embryo verpflanzt 10-13. Da diese inhärenten zellulären Eigenschaften in explantierten NC Vorfahren bewahrt werden, bietet das Neuralrohr Explantat Assay eine attraktive Option für das Studium der NC in vitro.

Um ein besseres Verständnis der Säuger NC zu erreichen, wurden viele Verfahren verwendet worden, um NC-Populationen zu isolieren. NC-abgeleitete Vorläuferzellen aus der Post-wandernde Standorten können sowohl im Embryo und Erwachsenen, die Dynamik des Post-NC wandernden Vorläuferzellen 11,14-20 studieren kultiviert werden, jedoch Isolierung von NC-Vorläuferzellen, wie sie aus dem Neuralrohr auswandern sorgt für eine optimale Erhaltung der NC-Zellen-Potenzial und wandernde Eigenschaften 13,21,22. Einige Protokolle verwenden fluorescence activated cell sorting (FACS), einen NC Bevölkerung für bestimmte Vorläuferzellen 11,13,14,17 bereichert zu isolieren. Allerdings, wenn beginnend mit frühen Embryonen, sind ausreichende Zellzahlen für die Analysen nur schwer mit FACS erhalten, erschwert die Isolierung des frühen NC populations aus einzelnen Embryonen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der nicht auf FACS Ergebnisse angewiesen ist und in einer etwa 96% reines NC Bevölkerung auf einem Wnt1-Cre-Reporter aktivierte Linie 23 basiert.

Das hier vorgestellte Verfahren ist von Protokollen für die Kultur von Ratten-NC 11,13 optimiert angepasst. Die Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Verfahren sind, daß 1) die Zellen nicht auf einer Feeder-Schicht, 2 gezüchtet) FACS ist nicht erforderlich, eine relativ reine NC Bevölkerung, 3 zu erhalten) premigratory NC Zellen isoliert und 4) Ergebnisse sind leicht quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Protokoll für die Isolierung von NC von jedem mutante Maus-Modell verwendet, die die Untersuchung der NC-Eigenschaften mit unterschiedlichen genetischen Manipulationen. Die Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die NC aus dem Kontext des Embryos, von denen bekannt ist, um das Überleben, Migration und Differenzierung der NC 2,24-28 zu beeinflussen, wird entfernt.

Protocol

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1. Vorbereiten von Platten

  1. Verwenden steriler Technik zu jeder Zeit.
  2. Planen Fibronektin (FN) durch Verdünnen von 100 ul Blutplasma FN Brühe in einem Endvolumen von 3,3 ml in Dulbeccos PBS (DPBS). Endkonzentration 30 ug / ml, und dies kann bei 4 ° C für 1 Woche aufbewahrt werden.
  3. Titelbild Boden jeder Vertiefung einer sterilen Gewebekultur vier Well-Platte mit FN-Lösung und lassen Sie sich für 15 Minuten. Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Machen Medien während dieser Zeit (die Schritte 2 und 3).
  4. Entfernen Sie FN-Lösung und erlauben Platten zum Trocknen auf. Vorsichtig spülen Wells mit 500 ul DMEM, DMEM entfernen, und fügen Sie 500 ul der Selbsterneuerung (SR) Medium (siehe unten). Bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO 2. Füllen Sie dieses etwa eine Stunde vor ihrer Zerlegung, so dass die Platten werden vor Gebrauch trocknen.

2. Vorbereiten SR Medium

  1. Für die Kultur des Vagus und des Rumpfes NCaus zehn Embryonen (etwa ein Wurf, je nach genetischem Hintergrund der Mauslinie), bereiten Sie 25 ml Medium SR. Kombinieren 12,5 ml niedrige Glukose-DMEM, 7,5 ml Neurobasalmedium, 25 ul Retinsäure (117 uM Endkonzentration) und 25 ul 2-Mercaptoethanol (50 mM Endkonzentration). Gut mischen.
  2. In 3,75 ml Hühnerembryo-Extrakt, 250 ul N 2 Salz Ergänzung, 500 ul B27 Ergänzung und 250 ul Penicillin-Streptomycin (1% Endkonzentration). Filtern Sie das Medium durch ein 0,22 um-Filter.
  3. Fügen Sie 10 ul sterilem IGF1 (20 ug / ml Endkonzentration) und 20 ul sterilem bFGF (20 ug / ml Endkonzentration). Mischen durch Invertieren. Lagerung bei 4 ° C.

3. Vorbereiten Waschmedium

  1. Für etwa 10 Embryonen vorzubereiten 50 ml Waschmedium. Kombinieren Sie 50 mg BSA mit 35 ml niedrige Glukose-DMEM, 15 ml Neurobasalmedium, und 500 ul Penicillin-Streptomycin (1% Endkonzentration). Sterilfilter mit einem 0,22um-Filter.

4. Vorbereiten Kollagenase / Dispase

  1. Dann werden 50 ul 100 mg / ml Collagenase / Dispase bis 5 ml DPBS. Gut mischen.
  2. Spritze mit Filter einen 0,2 um Filter und 1,5 mL in jedes der drei Vertiefungen einer zwölf Well-Platte. Pipette ca. 1 ml Wasch-mittel in den restlichen Brunnen. Bewahren gesamte Platte auf Eis, bis bereit, seziert Gewebe zu verdauen.
  3. Schneiden Sie Tipps eines P20 und P1000 Pipettenfilter Spitze mit einer sterilen Rasierklinge. Kurz unterhalb der abgeschrägten Kante der Spitze. Die abgeschnittenen P1000 wird verwendet, um den ganzen Embryo zu übertragen, während die p20 wird verwendet, um Stücke von isoliertem Gewebe übertragen werden kann.

5. Isolating Vagale und Trunk Neuralrohrs aus 9,5 DPC Embryonen

  1. Für zeitgesteuerte Schwangerschaften, sind Dämme mit einer vaginalen Stecker 0,5 DPC mittags als der Morgen der Stecker wird beobachtet. Opfern und entfernen die Gebärmutter bei 9,5 DPC.
  2. Entfernen Sie die Decidua von Gebärmutter und sanft rntfernen den Embryo aus der Decidua. Wenn mit diesem Protokoll erfahren, zu isolieren 3-4 9,5 dpc Embryonen zu einem Zeitpunkt in sterilem dPBS. Verwenden steriler Technik und sterilisiert Dissektionsinstrumente. Instrumente können durch Autoklavieren, Hitzesterilisation oder durch Inkubation in Ethanol sterilisiert werden.
  3. Für Front-vagalen NC: mit Insulin Nadeln, schneiden Sie das Neuralrohr in der Mitte Ohrplakode. Schneiden Sie wieder an der hinteren Kante des 4. Somiten. Trim Gewebe ventral des Neuralrohrs, die Schlundbögen und Herz zu entfernen.
  4. Für Stamm NC: mit Insulin Nadeln, entfernen Sie den Teil des Neuralrohrs zwischen Somiten 16-22 (oder der letzte Somiten, wenn Embryonen sind entwicklungsgeschichtlich älter als die 22 Somiten-Stadium).
  5. Halten Sie den Dottersack und alle verbleibenden embryonalem Gewebe für die Genotypisierung.

6. Entfernung von nicht-neuronalen Ektoderm und Mesoderm

  1. Legen Neuralrohr, die Segmente in Collagenase / Dispase bei Raumtemperatur für 10 Minutens. Unmittelbar in Waschmedium zu waschen.
  2. Zurück zur sterilen Gewebe dPBS. Mit einer sterilen Insulin-Nadeln, entfernen Sie vorsichtig die nicht-neuronalen Ektoderm aus dem Gewebe und trennen Sie die Somiten vom Neuralrohr. Die letzten Teile des Mesoderm von Somiten Gewebe kann durch Verreiben sanft mit einem Cut-down p20 Spitze entfernt werden. Seien Sie vorsichtig, um nicht zur Beschädigung des Neuralrohrs. Beachten Sie dies beim Zerreiben eng.
  3. Platzieren Sie die isolierten neuronalen Rohr durch einen zweiten und dritten 30 Sekunden Waschgang Waschmedium.
  4. Waschen einmal SR Medium, und legen die isolierten neuronalen Rohr in der Mitte eines FN-beschichteten, die zuvor hergestellt wurde (Schritt 1.3). Befeuchten die Hypoxie Kammer mit einem Gericht aus sterilem Wasser. Anschließend wird die Schale in die Kammer Hypoxie und spülen Sie die Kammer mit Mischgas bis 3% O 2 (verwenden Sie einen Tank mit einer Mischung aus 1% O 2, 6% CO 2, 93% N 2).
  5. Behandeln Sie die Kammer extrem vorsichtig zu gewährleisten that Explantate sind ungestört und bleiben in der Mitte der Brunnen.
  6. Bei 37 ° C. Zusammenfassung der Schritte 5-6 wird in 1 gezeigt.

7. Die Entfernung von Neuralrohrdefekten

  1. Nach 24 Stunden Inkubation, entfernen das Neuralrohr durch leichtes necken den Rand des Neuralrohr von den wandernden Zellen unter Verwendung einer sterilen Nadel Insulin. Entfernen und Entsorgen der Neuralrohr aus dem Medium mit einer sterilen p20 Schnitt wie in Schritt 6,2 und ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium SR (Abbildung 2). Dies geschieht am einfachsten mit einem inversen Mikroskop.

8. Repräsentative Ergebnisse

Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ° C in hypoxischen Bedingungen, NC-Zellen haben sich von dem Neuralrohr in einer nahezu reinen Population (Abbildung 3a) migriert. Manchmal wird als ideal Kulturen nicht nachgeben robust Auswüchse. Zum Beispiel ist es möglich, dass nach 24 Stunden ter Neuralrohr wird auf sich selbst zusammengerollt haben und der NC wird nicht wandern weg von der Neuralrohrdefekte (Abbildung 3b). Gelegentlich wird das Neuralrohr nicht auf die mit Fibronectin beschichteten Platten zu befestigen.

Nach unserer Erfahrung können suboptimale NC Migration oder Probleme mit der Befestigung des Neuralrohrs negativ durch Normoxie Bedingungen oder Konzentration des Fibronektin betroffen sein, jeweils. Die enzymatische Aktivität der Kollagenase / Dispase variiert leicht von Batch-und Verdauung Zeit entsprechend angepasst werden müssen, jedoch nicht verdauen das Gewebe länger als 15 Minuten. Overdigestion des neuronalen Gewebes in Röhrchen mit Collagenase / Dispase auch zu einer mangelhaften Auswüchse führen. Wenn Somiten Gewebe nicht leicht von dem Neuralrohr nach Inkubation in Collagenase / Dispase entfernt wird, kann das Neuralrohr länger als zehn Minuten lang inkubiert werden. Manchmal das Neuralrohr nicht an dem Substrat. Wenn dies der Fall, überprüfen Sie die fibronecZinn-Konzentration und die Hypoxie Bedingungen.

Während normoxischen Bedingungen zur Kultur Wildtyp-NC verwendet werden können, hypoxischen Bedingungen genauer nachahmen die in vivo-Umgebung 29,30. Nach unserer Erfahrung wurde hypoxischen Bedingungen kritisch, wenn die Kultivierung Mutanten NC. Zum Beispiel, wenn Foxd3 Mutante NC in normoxischen Bedingungen kultiviert wurden, hatten Stamm NC eine stark reduzierte Zelle Auswachsen im Vergleich zu Kontrollen. Dieses Missverhältnis in Auswuchs Größe wurde entfernt, wenn die Explantate in hypoxischen Bedingungen (Abbildung 4) kultiviert wurden. Darüber hinaus, wenn Wildtyp-Neuralrohr Explantaten in Normoxie kultiviert wurden, war die Anzahl der Caspase-positiven Zellen größer als die ähnlicher Explantaten in Hypoxie kultiviert (Daten nicht gezeigt). Durch die Beibehaltung aller NC-Kultur in Hypoxie, können Vergleiche zwischen einfacher Steuerung und Dynamik der mutierten Kulturen durchgeführt werden.

1
2 hypoxischen Bedingungen.

2
Abbildung 2. Schrittweise Entfernung von Neuralrohrdefekten aus Explantat. Das Neuralrohr muss nach 24-48 Stunden entfernt werden, um eine Kontamination mit nicht-NC-Zellen zu verhindern. A) Man beachte die Grenze zwischen dem Neuralrohr und der NC-Auswuchs (durchgezogene Linie). B) Schneiden Sie entlang der Kante des Neuralrohrs mit einer Insulin-Nadel. C) Entsorgen Sie das Neuralrohr und ersetzen Medium durch frisches Medium selbst zu erneuern. Eine gestrichelte Linie zeigt an, inwieweit der Auswuchs. Abkürzung: NT, Neuralrohr.


Abbildung 3. Beispiele für repräsentative Ergebnisse. A) Typische Explantat Auswachsen nach 24 Stunden Inkubation in Selbsterneuerung Medium in hypoxischen Bedingungen (gestrichelte Linie gibt Ausmaß der Auswuchs). B) Vergrößerte Ansicht von NC Auswuchs nach 48 Stunden in der Kultur. C) Weniger ideal Kultur mit geringer Ausbeute Auswuchs. A und C wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird. Bilder zeigen den natürlichen Verbreitungsgebieten in Kultur Robustheit. Dies kann durch die Effizienz des Neuralrohrs Isolation, Konzentration der FN, hypoxischen Bedingungen, und die Zeit in Kollagenase / Dispase Verdauung beeinträchtigt werden.

Abbildung 4
Abbildung 4. In-vitro-Analysen von NC Explantatkulturen in Normoxie gegenüber Hypoxie. Control (Wildtyp) NC-Zellen von Neuralrohr-Explantaten nach 48 Stunden in normoxischen Kulturbedingungen migriert. Im Gegensatz dazu Foxd3 MutanteNC war stark Zelle Auswüchse in Normoxie (rote Konturen Marke Kanten der NC Auswüchse) reduziert. Als vergleichbar Explantate unter hypoxischen Bedingungen angebaut wurden, wuchs Foxd3 mutierten NC-Explantate vergleichsweise zu den Kontrollen, so dass spätere Analysen. Beachten Sie, dieses Verhalten auch mit dem Verhalten der Foxd3 Mutante NC in vivo korreliert.

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Discussion

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Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Entwicklungsstufe des Embryos zu zahlen, um den Erfolg dieses Ansatzes zu gewährleisten. Zählen von Somiten frühe Mausembryonen ist sowohl für die Bühne passend Embryonen innerhalb eines Wurfes und der Bestimmung der richtigen Regionen des Neuralrohrs für die Isolierung von entscheidender Bedeutung. Eine Variation von ein oder zwei Somiten zwischen Embryonen ist innerhalb einer angemessenen Palette von der zeitlichen Entwicklung, abhängig von der Auflösung des Experiments durchgeführt. Ein Embryo zwischen 9 und 9,5 DPC müssen zwischen 17 und 25 Somiten. Wenn der Embryo hat mehr als 25 Somiten, wird der NC weiter in der Entwicklungsbiologie Zeit vorgerückt, und NC-Auswüchse werden weniger robust in der Kultur. Staging Embryonen basierend auf Somiten Anzahl erleichtert Präzision in Experimenten, bei Entwicklungsstadium des Embryos, und deshalb NC, das Ergebnis der Experimente beeinflussen kann. In einer 9,5-dpc Embryo, wandert der vagalen NC aus der dorsalen Neuralrohr in definierten Vorwärts-Rückwärts-Grenzen: aus der Mitte des Ohrplakode um Somiten 7.In ähnlicher Weise wandert Stamm NC vom Neuralrohr in Mengen Somiten 8-24 Somiten. Um unterschiedliche Populationen von NC-Vorläufern wie in diesem Protokoll beschriebenen isolieren, werden diskrete Teilregionen innerhalb jeder dieser Domänen isoliert. Die Region des Neuralrohrs verwendet wird basierend auf dem Design des Experiments und der Vorwärts-Rückwärts-Bereich des NC untersucht variieren.

Die Kulturbedingungen oben beschrieben, einschließlich der mittel-und Inkubationsbedingungen, sind speziell für die Kultur von Maus-NC angepasst. Ähnliche SR Medium wurde zuerst für die Kultur von Ratten-NC 11 verwendet. In unseren Händen, erzeugt diese Ratte Medium unter Zusatz von Neurobasal Medium, eine robuste Auswachsen von murinem NC Vorläuferzellen. Darüber hinaus, im Gegensatz zu früheren Arbeiten Kultivierung Vogelgrippe NC-Zellen, ist ein Feeder-Schicht unnötig für Kultur der Säugetier-NC mit dieser Methode 11,13,21,22. Zwar gibt es zahlreiche Protokolle detailliert sowohl Vogel-und Säugetier-NC-Kultur in normoxischen Bedingun 9,22 ons, wir 23 (Abbildung 4), zusammen mit anderen im Bereich 20, haben festgestellt, dass die Kultivierung muriner NC-Zellen in hypoxischen Bedingungen wie hier beschrieben stark Aids Überleben und die Selbsterneuerung, vermutlich weil Hypoxie stärker imitiert physiologische Sauerstoff-Niveaus innerhalb des Embryos 20,29,30.

Auswertung der Expression von molekularen Markern erleichtert die Identifizierung von NC-Zellen und ihrer differenzierten Derivate. Dazu gehören Expression von Foxd3, p75 und Sox10 für die NC-Stammzellen. Marker differenzierter NC gehören glatten Muskelzellen alpha Actin (SMA) für Myofibroblasten, gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) für Gliazellen, Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF) für Melanozyten, und beta-Tubulin III, Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5 ) und Peripherin für Neuronen. Diese Marker können verwendet werden, um Explantat Effizienz und Differenzierung von Vorläuferzellen NC zu bestimmen.

Inhalt "> Sobald diese Technik beherrschen, können kultivierten NC in einer Vielzahl von Tests, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zelltod, Migration Dynamik, und / oder Differenzierung Status verwendet werden. NC kann auch klonal kultiviert, um sich selbst zu erneuern oder Multipotenz untersuchen einzelne NC Vorläuferzellen 23. Nach dem Neuralrohr aus den Kulturen entfernt wird, trennen die NC-Zellen in 100 ul Trypsin-EDTA (0,25%) genau 5 Minuten bei 37 ° C gequencht Trypsin-EDTA über Waschmedium (8-10 ml) durch Zugabe von 800 ul pro Well und die Übertragung auf einzelne 15-ml-Röhrchen mit Waschmedium. vorsichtig zentrifugiert Zellen bei 150 × g für 3 Minuten wird Überstand und resuspendieren Zellpellet wurde in 1 ml Medium SR. Anzahl Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und sie auf Platte eine Dichte von 25 Zellen / cm 2. Diese Kolonien können seriell an Assay Selbsterneuerung passagiert werden. Um Assay Multipotenz, pflegen die NC-Zellen bei klonaler Dichte in SR Medium für 6 Tage und wechseln Sie dann zur DifferenzierungMedium (10 ng / ml bFGF und 1% Hühnerembryo-Extrakt). Kultur werden die Zellen in Differenzierungsmedium unter Hypoxie für 8 Tage vor der Analyse Kolonie Zusammensetzung mit molekularen Markern wie oben 11.

Abschließend liefert diese Methode zur Isolierung NC-Zellen aus Maus-Embryonen eine Zuführung freien adhärenten Kultur der premigratory NC-Zellen ohne die Verwendung von FACS. Die Analyse der Experimente mit diesen Zellen lassen sich leicht quantifizieren. Während diese Technik ist einfach, sind die Anwendungen für die Untersuchung von NC-Eigenschaften der Migration, Selbsterneuerung und Differenzierung groß. Darüber hinaus isoliert NC aus genetisch veränderten Maus-Embryonen erlaubt die direkte Betrachtung bestimmter Gene und Signalwege im Rahmen der NC Migration, das Überleben und / oder Differenzierung.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir möchten Marc Wozniak für Video-Hilfe anzuerkennen. Wir möchten auch Sean Morrison an der UT Southwestern anerkennen für das Original-Protokoll zur Kultivierung von Ratten-NC-Zellen. Diese Arbeit wurde Vanderbilt University Medical Center Academic Program-Support unterstützt und durch Zuschüsse der NIH (HD36720 und HD036720-11S109) und der AHA 11GRNT7690040 zu PAL, Chemiefonds Stipendien von der AHA (0615209B) und NIH (NS065604) zu NAM und ERP war unterstützt durch ein NIH Ausbildungsförderung T32HD007502.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 μm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 μm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

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References

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Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr
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Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).More

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

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