Summary

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

Published: June 02, 2012
doi:

Summary

神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に<em> in vitroで</em>移行、自己再生し、神経堤の多能性を研究するための方法。

Abstract

胚の神経堤(NC)は、神経管の背側面に由来する多能性前駆細胞集団である間葉移行(EMT)に上皮を受け、多様な細胞の種類1-3に上昇を与えて、胚全体に移行します。 NCはまた、標的器官4-6の分化と成熟に影響を与えるユニークな能力を持っています。 in vitroで外植する場合は、NC前駆細胞が自己再生を受けて、移行し、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨および骨を含む組織、さまざまな種類の細胞に分化する。

NCの多能性は、最初の鳥の神経管7-9の外植片から記述されていた。NC細胞 in vitro の分離では増殖、移行、および多能含むNCダイナミクスの研究を容易にします。胚10に戻って移植時に植NC細胞は、そのNCの可能性を保持することを明らかに鳥とネズミシステムの更なる作業-13。これらの固有の細胞の特性が植NC前駆細胞に保持されているため、神経管植アッセイは、in vitroでの NCを研究するための魅力的なオプションを提供しています。

哺乳類のNCのより良い理解を達成するために、多くのメソッドは、NC集団を分離するために採用されています。 NC-由来の前駆細胞がポスト渡り鳥NC前駆11,14-20のダイナミクスを研究するための胚と成人の両方で、ポスト渡り鳥の場所から培養することができる、しかし、彼らは神経管からの移住としてNC前駆細胞の分離は、最適な保全を提供していますNCの潜在的な細胞や渡り鳥プロパティ13,21,22。いくつかのプロトコルは、特定の前駆細胞11,13,14,17を濃縮NC人口を分離するために蛍光活性化細胞選別(FACS)を採用しています。しかし、初期段階の胚から始まるときは、分析のための十分な細胞数は初期のNC populatioの分離を複雑にし、FACSを得ることが困難である個々の胚からNS。ここでは、Wnt1-Creリコンビナーゼ活性化系レポーター23に基づいて約96%純粋なNC集団のFACS、その結果に依存しないアプローチを説明します。

ここで紹介する方法は、ラットNC 11,13の培養に最適化されたプロトコルから構成されている。このプロトコルは、従来の方法に比べての利点は、1)細胞はFACS))は、比較的純粋なNCの人口、3を取得する必要はありませんpremigratory NC細胞が分離されている、4)フィーダー層2上に成長されていない結果が簡単にあることです。定量化した。さらに、このプロトコルは、異なる遺伝的操作とNC特性の研究を促進し、任意の変異マウスモデルからNCの分離に使用することができます。このアプローチの制限は、NCはNC 2,24-28の生存、遊走、分化に影響を及ぼすことが知られている胚のコンテキストから削除されていることです。

Protocol

1。プレートの準備すべての回で無菌テクニックを使用しています。 ダルベッコPBS(DPBS)3.3 mLの最終容量にヒト血漿FNの株式の100μLを希釈することによってフィブロネクチン(FN)を準備します。最終濃度は30μg/ mLであり、これは1週間に4℃で保存することができます。 FN溶液を滅菌組織培養4ウェルプレートの各ウェルの底をカバーし、15分間放置します。表面全体が覆?…

Discussion

細心の注意は、このアプローチの成功を確実にするために胚の発達段階に支払わなければなりません。マウス初期胚の体節を数えると、ごみの中に胚を照合し、絶縁のための神経管の適切な領域を決定する段階の両方が重要です。胚の間に1つまたは2つの体節のバリエーションが行った実験の解像度に応じて、発生のタイミングの合理的な範囲内である。 9と9.5の間に胚は、DPCは17〜25体節が?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、ビデオ援助をマークウォズニアックを承認したいと思います。また、培養ラットNC細胞の元のプロトコルのためのUTの南西で、ショーン·モリソンを承認したいと思います。この作品は、ヴァンダービルト大学医療センターアカデミックプログラムのサポートを支持し、NIH(HD36720とHD036720-11S109)とPALにAHA 11GRNT7690040、NAMにAHA(0615209B)とNIH(NS065604)から博士号を取得する前の奨学金と、ERPからの補助金によってであったNIH訓練助成金T32HD007502によってサポートされています。

Materials

Reagent Company Catalogue number Comments
DMEM (low glucose) Gibco/Invitrogen 11885  
Neurobasal Medium Gibco 21103  
BSA Sigma A3912-10G  
dPBS Gibco 14190-144  
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin Gibco 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid Sigma R2625 Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol Sigma D-5637  
N2 supplement Gibco 17502-048  
B27 supplement Gibco 17504-044  
Steriflip 0.22 μm filters Millipore SCGP00525  
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140122  
0.20 μm filters Corning 431219  
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604  
Four well plates Thermo Fisher Scientific 176740  
Collagenase/Dispase Roche 269 638 Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles
(29½ gage)
Becton Dickson 309306  
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg    
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg    
Forceps #5 Fine Science Tools   For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200  

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Cite This Article
Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

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