Summary
Ice bindingseiwitten (IBP), ook bekend als antivrieseiwitten, remmen ijsgroei en een veelbelovende toevoegingsmiddelen in de cryopreservatie van weefsels. Het belangrijkste instrument dat wordt gebruikt om IBP te onderzoeken is de nanoliter osmometer. We ontwikkelden een huis ontworpen koeling stadium gemonteerd op een optische microscoop en gecontroleerd met behulp van een custom-built LabVIEW routine. De nanoliter osmometer hier beschreven gemanipuleerd het monster temperatuur in een ultra-gevoelige manier.
Protocol
0. Voorlopige Procedures
- Glascapillair voor oplossing injectie. Met een capillair trekker (Narishige, Tokyo, Japan), bereidt een scherpe pipet met een fijne opening van een glazen capillaire micro tube (Brand GMBH, Wertheim, Duitsland). De grootte van de opening moet worden gecontroleerd door lucht door de capillaire om fijne borrelen verkrijgen schoon water. Als het capillair wordt gesloten, dan kan men openen door het breken van de rand. Dit kan worden bewerkstelligd door of krassen zachtjes tegen de water bevattende buiswanden. Bereid de capillaire zodanig dat de opening wordt geblokkeerd bijna maar voldoende open is om de vorming van sub-millimeter bellen mogelijk te maken.
- Koperen schijf schoon te maken. Sonificeer de koperen schijven gedurende 10 minuten in 0,1% Micro-90 zeep (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), daarna wassen met tweemaal gedestilleerd water. Breng de schijven in een isopropanol (technische) oplossing en ultrasone trillingen opnieuw gedurende 10 minuten. Vinbondgenoot, droog de schijven met behulp van gefilterde lucht. Deze reinigingsstap is kritisch voor IBP verontreiniging tussen experimenten te voorkomen.
- Double-layer coverglass assemblage. Een dekglaasje assemblage bereid was om voor het monster observatie mogelijk te maken zonder condensatie vocht op de cover glasoppervlak. Dit werd bereikt door een drieriet (WA Hammond drieriet, Xenia, Ohio, USA) deeltje (2 mm in diameter) tussen twee dekglaasjes die vervolgens werden gelijmd met een hot lijmpistool. Deze configuratie voorkomen condensatie dat het zicht kunnen blokkeren wanneer het monster afgekoeld tot lage temperaturen en verwijderd de noodzaak om droge lucht te blazen op het kijkvenster.
1. Koeling Stage Set-up
- Sluit de watertoevoer en afvoer van de koeling fase tot 4 mm binnendiameter Tygon buizen (Saint-Gobain, Parijs, Frankrijk), en sluit de waterstroom inlaatbuis aan een waterpomp.
- Sluit een 4 mm binnendiameter Tygon buis naar de inlaat van de koeltrap to leveren droge lucht. De lucht werd gedroogd met behulp van een in-line drieriet kolom.
- Bedien de lucht en het water pompen. Merk op dat de koelelementen niet mag worden uitgevoerd zonder een koellichaam.
- Zet de temperatuurregelaar, camera, en LabVIEW routine.
2. Monstervoorbereiding
- Plaats een 3-4 ul druppel immersie olie B (Cargille laboratoria, Cedar Grove, New Jersey, USA) aan de achterzijde van een 7 mm diameter koperen schijf met 500 urn openingen geboord door de disc.
- Plaats de koperen schijf op de koeling podium met de immersie olie naar beneden.
- Sluit de capillair (de botte kant) een 0,7 mm binnendiameter Tygon buis aan het andere uiteinde op een 2 ml glazen injectiespuit (Poulten-Graf, Wertheim, Duitsland).
- Alvorens de capillaire buis, controleert de kleine opening van het capillair dat de opening een geschikte grootte (zie Preliminary procedures).
- Langzaam steek de glass capillair in de voorbehandelde IBP eiwit monsterbuis (2,4 uM Mp IBP-GFP in 20 mM CaCl2 en 25 mM Tris-HCl bij pH 8, zie referentie 10 voor de bereiding details) en trek de glazen spuit totdat de glazen capillair bevat 0,1 pi van de eiwitoplossing.
- Begin de video-opname via de LabVIEW software.
- Plaats de scherpe rand van de glazen capillair (bevattende de proteïne oplossing) in een van de gaten in de koperen plaat op de koelfase.
- Met inachtneming van door de microscoop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x objectief), zorgvuldig doordringen in de olie-immersie laag met de glazen capillaire tip, en druk op de glazen injectiespuit (zeer fijn) om een kleine hoeveelheid (~ 10 nl) van het eiwit te leveren oplossing voor een 200 urn druppel maken.
- Bedek het gat in de koeling podium met de dubbele laag coverglass terug (zie de inleidende procedures).
3. TH activiteitsmeting
- Press de koeling knop en stel de temperatuur tot -40 ° C.
- Aanvankelijk zal de waterdruppel duidelijk. Bij lage temperaturen, kenmerkend in het bereik -30 ° C tot -35 ° C, de druppel verandert van kleur, wat aangeeft dat de oplossing bevroren. Onmiddellijk nadat het monster bevroren is, langzaam de temperatuur totdat de bulk ijs smelt. Een geleidelijke verhoging van de temperatuur is noodzakelijk om overschrijding van de temperatuur die kunnen leiden tot het volledig smelten van het monster te voorkomen.
- Schakel over naar een 50x objectief en beginnen om het ijs te smelten door het aanpassen van de temperatuur. Deze aanpassing is interactief, en de laatste stappen worden doorgaans uitgevoerd met kleine stappen temperatuur van 0.002 ° C. Blijf smelten tot een enkele kristal blijft. De uiteindelijke grootte van het kristal moeten circa 10 um. De hoogste temperatuur waarbij smelten niet meer bepaald het smeltpunt en nauwkeurig bepaald in de latere video analyse. <li> Stel de temperatuur in enkele honderdsten van een graad Celsius beneden het smeltpunt van het kristal en beginnen een temperatuurverhoging met een 10 min vertraging. Pas de ramping de gewenste snelheid. Gedurende deze tijd, wordt het kristal worden blootgesteld aan de IBP.
- Na voltooiing van de 10 min belichtingstijd, de temperatuur automatisch afnemen onder de controle van de LabVIEW routine.
- Let op de kristal vorm als de temperatuur daalt. Op een bepaald punt kan het plotselinge uitbarsting van de ijskristallen worden waargenomen. De temperatuur waarbij dit gebeurt wordt genoteerd als het kristal burst temperatuur.
- Gebruik video analyse om de juiste smeltpunt en de burst temperatuur te bepalen. Ten eerste, door het gebruik van video-analyse, vinden de nauwkeurige smeltpunt. Bedenk dat de hoogste temperatuur waarbij smelten niet meer bepaald het smeltpunt. Documenteer dit smeltpunt in een spreadsheet programma. Vervolgens bepalen de nauwkeurige kristal barstte temperatuur, en documenteren van deze waardeook. Het verschil tussen het smeltpunt en het vriespunt of kristal burst temperatuur, is de thermische hysteresis activiteit van de IBP oplossing.
4. Meting van de tijd-afhankelijke TH activiteit
- Volg het protocol beschreven in secties 3.1-3.3 een eenkristal van ijs te bereiden.
- Na de vorming van het kristal, stelt u de vertragingstijd van de helling naar wens, en zet op de helling.
- De temperatuur daalt tegen een vaste rente (volgens de exploitanten eisen) automatisch zodra de ramp vertragingstijd is verstreken.
- Noteer de temperatuur waarbij het kristal scheuren. Bereken de belichtingstijd (de tijd tussen kristalvorming en het kristal burst).
- Herhaal het experiment met verschillende vertragingen en plot de TH activiteit als functie van de belichtingstijd van de tijdsafhankelijkheid van de TH activiteit te evalueren.
Representative Results
Meting van de TH tijdsafhankelijkheid
De LabVIEW bediende nanoliter osmometer vergemakkelijkt de prestaties van nauwkeurige TH-activiteit metingen. De constante temperatuur reductie toegestaan de meting van de TH tijdsafhankelijkheid. De nauwkeurige temperatuurregeling mogelijk gemaakt door de nanoliter osmometer was essentieel voor deze experimenten. De blootstellingstijd van een ijskristal de IBP in oplossing wordt gedefinieerd als de periode van de vorming van het kristal (het einde van het smeltproces) tot de plotselinge groei van ijs rond het kristal (crystal burst). We vonden dat de belichtingstijd van de ijskristallen op de IBP's cruciaal de TH activiteit beïnvloed. Kortstondig IBP blootstelling (enkele seconden) die een laag TH activiteit in de Mp IBP-GFP oplossing (2,4 uM) (figuur 5). De TH-activiteit steeg met IBP belichtingstijd totdat een plateau op 4 min. IBP blootstelling. Bij hogere concentraties IBP, de plaatau werd bereikt op kortere tijden.
Figuur 1. Schematisch diagram IBP geadsorbeerd op ijs. Aangenomen met toestemming van 10.
Figuur 2. De koelfase. A) met de buizen op de microscoop. B) Zonder de bovenste leiding. C) Schematisch diagram.
Figuur 3. Screenshot van de LabVIEW interface. ClICK hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Temperatuurstabiliteit grafiek. De temperatuurregelaar is ingesteld op de temperatuur 0,01 ° C om de 15 sec te verlagen.
Figuur 5. Mp IBP TH activiteit als functie van ijskristal blootstellingstijd aan IBP. Elk tijdstip is het gemiddelde van 3-6 experimenten.
Discussion
Dit werk toont de werking van een computergestuurde nanoliter osmometer dat nauwkeurige metingen van TH activiteit maakt met buitengewone temperatuurregeling. In elk temperatuurgevoelige systeem moet ongewenste temperatuurgradiënten worden vermeden. Om temperatuurgradiënten in de inrichting hier gepresenteerde vermijden moet de testoplossing druppeltje worden geplaatst in het midden van een gat in de koperen schijf koelstap (stap 2,7). Bovendien moet de enkelkristal in het midden van de druppel niet bij de randen (in de meeste gevallen zal spontaan). De beschreven tijdsafhankelijkheid geeft aan dat de afkoelsnelheid kunnen het TH metingen. Dus stellen wij name een rapport van de tijd gedurende welke de kristallen werden blootgesteld vóór de oplossing afkoelen en de koelsnelheid. We meestal wachtten 10 minuten voorafgaand aan uitlopen van de temperatuur op 0,01 ° C stappen elke 4 sec.
De LabVIEW-gecontroleerde cooling fase is aangepast voor gebruik met een omgekeerde microscoop waarop microfluïdische apparaten thermisch kunnen worden gemanipuleerd. Dit systeem maakt de uitvoering van oplossing uitwisseling experimenten met ijskristallen en IBP gelabeld met eGFP 9, 10, 16. De LabVIEW gecontroleerd systeem kan worden aangepast aan een Clifton stadium op door de temperatuurregelaar 3040 via een aangewezen aanpassing elektrische circuit. Een dergelijk systeem wordt bediend in de Davies lab 17. De LabVIEW software en de aangewezen aanpassing elektrische circuit ontwerp voor de Clifton stadium zijn beschikbaar op aanvraag.
Concluderend beschrijven we een nanoliter osmometer de gevoelige controle en manipulatie van de temperatuur en de snelheid van temperatuurstijging en afname (met 0,002 ° C gevoeligheid), gecoördineerd met een video interface met een LabVIEW routine voor real-time analyse vergemakkelijkt. Dit systeem kan uitvoeren reproduceerbaar percentage gecontroleerde experimenten die zijn important voor het onderzoeken van de kinetiek van IBP interacties met ijs. Dergelijke experimenten kunnen richten verschillende lang gedebatteerd problemen rond het werkingsmechanisme van IBP's.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de ISF, NSF, en ERC. We willen graag technische hulp te erkennen met de temperatuur etappe van Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, en Jeremy Dennison. Hulp bij software ontwikkeling werd geleverd door of Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy en Sumit Bhattachary. Wij willen onze medewerkers prof. Peter L. Davies en dr. Laurie A. Graham bedanken voor de Mp IBP eiwit en behulpzaam discussies. We danken ook lab-leden Dr Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr Yeliz Celik, Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, en Shlomit Guy voor hun feedback van gebruikers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
