Summary
Ice bindande proteiner (IBPS), även kända som antifrysproteiner, inhiberar is tillväxt och är en lovande tillsatsmedel för användning vid kryokonservering av vävnader. Det viktigaste verktyget som används för att undersöka IBPS är nanoliter osmometer. Vi utvecklade ett hem utformad kylsteg monterad på ett optiskt mikroskop och kontrolleras med hjälp av en specialbyggd LabVIEW rutin. Den nanoliter osmometer beskrivs här manipulerade provtemperaturen i en ultra-känslig sätt.
Protocol
0. Preliminära förfaranden
- Glaskapillär för lösning injektion. Med hjälp av en kapillär avdragare (Narishige, Tokyo, Japan), förbereda en skarp pipett med en fin öppning från en glaskapillär mikro rör (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Storleken på öppningen bör verifieras genom att leda luft genom kapillären för att erhålla fina bubbling i rent vatten. Om kapillären är stängd, så kan man öppna den genom att bryta dess kant. Detta kan åstadkommas genom att trycka eller skrapa försiktigt mot vattnet innehållande rörväggarna. Förbered kapillären så att öppningen nästan är blockerad men tillräckligt öppna för att tillåta bildning av sub-millimeter bubblor.
- Koppar-skiva rengöring. Sonikera koppar skivor för 10 min i 0,1% Micro-90 tvål (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), tvätta sedan med dubbeldestillerat vatten. Introducera skivorna till en isopropanol (teknisk) lösning och sonikera igen under 10 min. Finbundsförvant, torka skivor med filtrerad luft. Denna reningssteg är avgörande för att undvika IBP förorening mellan experiment.
- Dubbla lager täckglas församling. En täckglas församling var beredd att medge prov observation utan kondensering fukt på omslaget glasytan. Detta uppnåddes genom att placera en Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikel (2 mm i diameter) mellan två täckglas som sedan limmats med en limpistol. Denna konfiguration förhindrade kondens som kan blockera vyn när provet kyldes till låga temperaturer och bort behovet av att blåsa torr luft på observationsfönstret.
1. Kylning Stage Set-up
- Anslut inloppet vattenflöde och utlopp kylsteget till 4 mm innerdiameter Tygon-rör (Saint-Gobain, Paris, Frankrike), och anslut vattenslangen flödet inlopp till en vattenpump.
- Anslut en 4 mm inre rördiameter Tygon till inloppet av kylningssteget to leverera torr luft. Luften torkades med användning av en in-line-Drierite-kolonn.
- Manövrera luft och vatten pumpar. Notera att kylelementen inte ska köras utan en kylfläns.
- Slå på temperaturkontroll, kamera och LabVIEW rutin.
2. Provberedning
- Placera ett 3-4 pl droppe av immersionsolja B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på baksidan av en 7 mm diameter koppar skiva med 500 pm hål borrade genom skivan.
- Placera koppar skivan på kylsteg med immersionsolja nedåt.
- Anslut kapillärröret (den trubbiga kanten) till en 0,7 mm innerdiameter Tygon rör anslutet vid den andra änden till en 2 ml glasspruta (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland).
- Före användning av kapillärröret, kontrollera den lilla öppningen av kapillären för att säkerställa att öppningen är en lämplig storlek (se Inledande förfaranden).
- Långsamt in glass kapillär i den förberedda IBP proteinet provröret (2,4 M Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl 2 och 25 mM Tris-HCl vid pH 8, se referens 10 för beredning detaljer) och dra glasspruta tills glaskapillär innehåller 0,1 il av proteinlösningen.
- Börja videoinspelning via LabVIEW programvara.
- Sätt den skarpa kanten av glaset kapillären (innehållande proteinlösningen) i ett av hålen i koppar skivan på kylningssteget.
- Medan observerar genom mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x mål), försiktigt penetrera lagret immersionsolja med glaskapillär spetsen och tryck på glassprutan (mycket fint) för att leverera en liten mängd (~ 10 NL) av proteinet lösning för att skapa en 200 um droppe.
- Täck hålet i kyl scenen med dubbla lager täckglas församling (se preliminära förfaranden).
3. TH-aktiviteten Mätning
- Press kyl-knappen och ställ in temperaturen till -40 ° C.
- Initialt kommer lösningsdroppe vara klar. Vid låga temperaturer, typiskt i intervallet -30 ° C till -35 ° C, droppen ändrar färg, vilket indikerar att lösningen har frysts. Omedelbart efter det att provet har frusit, öka temperaturen långsamt tills huvuddelen isen börjar smälta. En gradvis ökning av temperaturen är nödvändig för att undvika överskridande av den temperatur som kan leda till fullständig smältning av provet.
- Byt till en 50x objektiv och börjar smälta isen genom att justera temperaturen. Denna justering är interaktiv, och de slutliga stegen utförs typiskt med användning av små temperatur steg 0,002 ° C. Fortsätt att smälta tills en enda kristall kvarstår. Den slutliga storleken för kristallen bör ligga runt 10 | im. Den högsta temperatur vid vilken smältning har upphört bestäms vara smältpunkten och bestäms noggrant i den senare videoanalys skede. <li> Ställ in temperaturen till ett fåtal hundradelar av en grader celsius under smältpunkten av kristallen och börja en temperaturramp med en 10 min fördröjning. Justera ramp takt som önskas. Under denna tid, kommer kristallen att utsättas för IBPS.
- Vid fullbordande av 10 min exponering tid, kommer temperaturen sjunka automatiskt under kontroll av LabVIEW rutinen.
- Observera kristall form när temperaturen sjunker. Vid någon punkt, kan det plötsliga utbrottet av iskristallen observeras. Den temperatur vid vilken detta inträffar noteras som kristallen brast temperaturen.
- Använda video för att bestämma den exakta smältpunkten och skuren temperaturen. Först med hjälp av videoanalys, hitta den exakta smältpunkten. Minns att den högsta temperatur vid vilken smältning har upphört bestäms vara smältpunkten. Dokumentera detta smältpunkt i ett kalkylprogram. Sedan bestämmer den exakta temperaturen kristall brast, och dokumentera detta värdesamt. Skillnaden mellan smältpunkten och fryspunkten, eller kristall brista temperatur, är den termiska hysteres aktiviteten IBP lösningen.
4. Mätning av Tidsberoende TH aktivitet
- Följ protokollet beskrivet i avsnitt 3,1-3,3 att framställa en enda kristall av is.
- Efter bildning av kristallen, ställa in fördröjningstiden för rampen såsom önskas, och slå på rampen.
- Temperaturen kommer att sjunka till en fast ränta (enligt operatörernas krav) automatiskt när rampen fördröjningstiden har passerat.
- Dokumentera den temperatur vid vilken kristallen skuren uppträder. Beräkna exponeringstiden (tiden mellan kristallbildning och kristallen skur).
- Upprepa experimentet för olika fördröjningstider och plotta TH-aktiviteten som en funktion av exponeringstiden för att utvärdera den tid beroende av TH-aktiviteten.
Representative Results
Mätning av TH tidsberoende
Den LabVIEW-drivna nanoliter osmometer underlättar utförandet av noggranna mätningar TH aktivitet. Den konstant temperatur reduktionshastighet tillät mätning av TH tidsberoende. Den exakta temperatur aktiverad av nanoliter osmometer var avgörande för dessa experiment. Exponeringstiden för en iskristall till IBPS i lösning definieras som tidsperioden från bildandet av kristallen (slutet av smältningsprocessen) tills den plötsliga ökningen av is runt kristallen (kristall skur). Vi fann att exponeringstiden för iskristallerna till IBPS avgörande påverkat TH-aktiviteten. Korta perioder av IBP exponering (några sekunder) gav en låg TH-aktiviteten i MP IBP-GFP-lösning (2,4 M) (Figur 5). TH-aktiviteten ökade med IBP exponeringstid tills den nådde en platå vid 4 minuter IBP exponering. Vid högre IBP koncentrationer plattanAU nåddes vid kortare tider.
Figur 1. Visar schematiskt IBPS adsorberas till is. Antagen med tillstånd från 10.
Figur 2. Kylsteget. A) Ansluts till rör på mikroskopet. B) Utan den övre ledningen. C) Principschema.
Figur 3. Skärmdump på LabVIEW-gränssnittet. ClICK här för att visa större bild.
Figur 4. Temperaturstabilitet graf. Temperaturregulatorn sattes för att sänka temperaturen 0,01 ° C var 15 sek.
Figur 5. Smp IBP TH-aktiviteten som en funktion av iskristall exponeringstid för IBPS. Varje tidpunkt är medelvärdet av 3-6 experiment.
Discussion
Detta arbete demonstrerar driften av en datorstyrd nanoliter osmometer som möjliggör noggranna mätningar av TH-aktiviteten med utomordentlig temperaturkontroll. I varje temperatur-känsligt system, måste oönskade temperaturgradienter undvikas. För att undvika temperaturgradienter i apparaten som presenteras här, skall testlösningen droppen placeras i mitten av ett hål i kopparskivan kylsteget (steg 2,7). Dessutom bör den enda kristallen vara i centrum av droppen snarare än nära kanterna (i de flesta fall kommer detta att ske spontant). Tidsberoendet beskrivna visar att kylningshastigheten kan påverka TH avläsningar. Sålunda föreslår vi inklusive en rapport av den tid under vilken kristallen exponerades för lösningen före kylning, liksom kylningshastigheten. Vi väntade typiskt 10 min före ramp ner temperaturen vid 0,01 ° C steg vardera 4 sek.
De LabVIEW-kontrollerade samarbeteoling etappen anpassad för användning med ett omvänt mikroskop som mikrofluidikanordningar kan termiskt manipuleras. Detta system underlättar att testa lösningen utbyte som inbegriper iskristaller och IBPS etiketten EGFP 9, 10, 16. LabVIEW-styrda systemet kan anpassas till en Clifton steg genom att ansluta 3040 temperaturregulator via en utsedd anpassning elektrisk krets. Ett sådant system används i Davies labbet 17. Den LabVIEW programvara och den utsedda anpassa elektrisk krets design för Clifton scenen finns tillgängliga på begäran.
Sammanfattningsvis beskriver vi en nanoliter osmometer som underlättar känsliga kontroll och manipulation av temperatur och graden av temperaturen öka och minska (med 0,002 ° C känslighet), samordnas med en video-gränssnitt via en LabVIEW rutin för realtidsanalys. Detta system kan utföra reproducerbara kurs-kontrollerade experiment som är important för att undersöka kinetiken för IBP interaktioner med is. Sådana experiment kan ta flera långa omdebatterade frågorna kring verkningsmekanismen för IBPS.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ISF, NSF och ERC. Vi vill tacka för teknisk hjälp med temperaturen steg från Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, och Jeremy Dennison. Hjälp med mjukvaruutveckling tillhandahölls av Eller Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy och Sumit Bhattachary. Vi vill tacka våra medarbetare Prof. Peter L. Davies och Dr Laurie A. Graham för Mp IBP protein och hjälp diskussioner. Vi tackar också lab medlemmar Dr Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr Yeliz Celik, Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy och Shlomit kille för sin användarfeedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
