Summary
Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.
Protocol
0. Ön Prosedürler
- Cam çözüm enjeksiyon için kısımdır. Kılcal çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanarak, bir cam kapiller mikro tüp (Marka GMBH, Wertheim, Almanya) ince bir açılış ile keskin bir pipet hazırlayın. Açıklık boyutu temiz su içinde ince köpürme sağlamak için kılcal içinden hava geçirerek doğrulanması gerekir. Kılcal kapalı ise, o zaman bir kenarından kırarak açabilirsiniz. Bu tüp duvarları içeren suya karşı bastırarak ya da hafifçe kazınarak gerçekleştirilebilir. Açılış neredeyse bloke edilir ama yeterince milimetrenin altındaki kabarcık oluşumuna izin açık olduğunu kapiller gibi hazırlayın.
- Bakır disk temizleme. Çift distile su ile yıkayın, daha sonra% 0.1 Mikro-90 sabun (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, ABD) 10 dk bakır diskler sonikasyon. Bir izopropanol (teknik) çözeltisi içine diskler tanıtın ve 10 dakika için tekrar sonikasyon. Yüzgeçmüttefiki, filtrelenmiş hava kullanarak diskleri kurutun. Bu temizlik aşamasında deneyler arasındaki IBP kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir.
- Çift katmanlı coverglass montaj. A coverglass montaj kapağı cam yüzeyindeki nem yoğuşma olmadan örnek gözlem için izin vermek için hazırlanmıştır. Bu daha sonra bir sıcak tutkal tabancası ile yapıştırılmıştır iki lamelleri arasında Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, ABD) parçacık (çapı 2 mm) koyarak elde edildi. Bu konfigürasyon örnek düşük sıcaklıklara soğutulur ve gözlem penceresi üzerinde kuru hava üflemek için ihtiyaç kaldırıldı görünümünü blok olabilir yoğunlaşma engellemiştir.
1. Soğutma Sahne Kurulumu
- 4 mm iç çaplı Tygon tüp (Saint-Gobain, Paris, Fransa) ile soğutma aşamasında su akışı giriş ve çıkış bağlan, ve bir su pompası, su akışının giriş tüpü bağlanır.
- Soğutma aşaması t girişine 4 mm'lik bir iç çap Tygon tüp bağlankuru hava teslim o. Hava bir in-line Drierite kolon kullanılarak kurutulmuştur.
- Hava ve su pompaları çalıştırın. Soğutma elemanları bir soğutucu olmadan çalıştırmak gerektiğini unutmayın.
- Sıcaklık kontrol, kamera ve LabVIEW rutin açın.
2. Örnek Hazırlanması
- Disk ile delinen 500 mikron delikleri olan bir 7 mm çapında bakır diskin arka tarafında immersiyon yağı B (Cargille laboratuarlar, Cedar Grove, New Jersey, ABD) bir 3-4 ul damlacığı yerleştirin.
- Aşağı bakacak immersiyon yağı tarafı ile soğutma sahnede bakır diski yerleştirin.
- 2 ml'lik bir cam şırıngaya (Poulten-Graf, Wertheim, Almanya) için diğer uçta bağlanmış bir 0.7 mm iç çaplı Tygon tüp ile bağlantı borusu (küt kenar) bağlanır.
- Önceki kapiler tüp kullanarak, açılış (Ön prosedürler bakın) uygun bir büyüklükte olduğundan emin olmak için kılcal küçük deliğini kontrol edin.
- Yavaşça gla takınss hazırlanan IBP protein örnek tüpü (pH 8 20 mM içinde 2.4 uM Mp IBP-GFP CaCl2 ve 25 mM Tris-HCl, hazırlama ayrıntılar için referans 10) içine kılcal ve kılcal cam 0.1 içerene kadar cam şırıngaya çekme Protein çözeltisi, ul.
- LabVIEW yazılımı ile video kayıt başlayın.
- Soğutma aşamasında bakır disk içinde deliklerin biri içine kılcal cam (protein çözeltisi içeren) keskin kenar yerleştirin.
- (Olympus, Tokyo, Japonya, 10x objektif) mikroskop ile dikkat ederken, dikkatle cam kapiller ucu daldırma yağ tabakası nüfuz ve protein az miktarda (~ 10 nl) sunmak için cam şırınga (çok ince) tuşuna basın 200 mikron damlacık oluşturmak için bir çözüm.
- Çift katmanlı coverglass montaj (Ön Prosedürler bakınız) ile soğutma aşamasında deliği kapatın.
3. TH Etkinlik Ölçümü
- Önss soğutma düğmesi ve -40 sıcaklığını ayarlamak ° C
- Başlangıçta, çözüm damlacık açık olacaktır. Düşük sıcaklıklarda, tipik aralık içinde -30 ° C ile -35 çözelti dondurulmuştur belirten ° C, damlacık renk değiştirir. Toplu buz erimeye başlayana kadar örnek donduktan hemen sonra, yavaş yavaş sıcaklığını arttırın. Sıcaklığın bir kademeli artış numune tamamen erimesi neden olabilir sıcaklık aşılmaz önlemek için gereklidir.
- Bir 50x objektif geçin ve sıcaklığını ayarlayarak buz erimeye başlar. Bu ayarlama, interaktif, ve son aşamalar, genellikle 0,002 ° C arasında küçük sıcaklık aşamalarını kullanarak gerçekleştirilir Tek bir kristal kalmayana kadar erimeye devam edin. Kristalin nihai boyutu 10 mikron civarında olmalıdır. Erime durdurulmuştur olan en yüksek ısı erime noktası olarak tespit edilir ve daha sonra video analiz aşamada doğru şekilde belirlenir. <li> kristalin erime noktasının altındaki bir santigrat derece arasında birkaç yüzde için sıcaklığına getirin ve 10 dakika gecikme ile bir sıcaklık rampası başlar. Istediğiniz gibi rampalanma oranını ayarlayın. Bu süre zarfında, kristal IBPs maruz kalacağı.
- 10 dakika maruz kalma süresi tamamlandıktan sonra, sıcaklık LabVIEW rutin otomatik olarak kontrol altında azalacaktır.
- Sıcaklık azaldıkça olarak kristal şekli dikkate alınmalıdır. Bir noktada, buz kristali ani patlama görülebilir. Bu gerçekleştiği sıcaklık kristal patlama sıcaklığı olarak not edilir.
- Doğru erime noktası ve patlama sıcaklığı belirlemek için video analiz kullanın. İlk olarak, görüntü analizleri kullanılarak, kesin erime noktası bulabilirsiniz. Erime bittikten hangi yüksek sıcaklık erime noktası olmaya kararlı olduğunu hatırlayın. Bir elektronik tablo programı bu erime noktası belgeleyin. Sonra, hassas kristal patlama sıcaklığı belirlemek ve bu değeri belgelemekgibi. Erime noktası ve donma noktası, veya kristal patlama sıcaklık arasındaki fark IBP çözeltisinin termal histerezis faaliyettir.
4. Zamana bağlı TH Aktivitenin Ölçümü
- Buzun tek bir kristali hazırlamak için Bölüm 3.1-3.3 de tarif edilen protokol takip edin.
- Kristal oluşumunu sonra, istediğiniz gibi rampa gecikme süresini ayarlamak ve rampa açın.
- Sıcaklığı otomatik kez rampa gecikme süresi dolduktan (operatörlerinin ihtiyaçlarına göre) sabit bir oranda azalacaktır.
- Kristal çoğuşma oluştuğu sıcaklık belge. Pozlama süresi (kristal oluşumu ve kristal patlama arasındaki zaman) hesaplayın.
- Çeşitli gecikme zamanları için deney tekrarlayın ve TH aktivitesi zaman bağımlılığı değerlendirmek için maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak TH aktivitesi çizmek.
Representative Results
TH zaman bağımlılık ölçümü
LabVIEW çalışan nanolitre Osmometer doğru TH aktivitesi ölçümleri performansı kolaylaştırır. Sabit sıcaklık azalma oranı TH zaman bağımlılık ölçümü izin. Nanolitre Osmometer tarafından etkinleştirilmiş hassas sıcaklık kontrolü bu deneyler için çok önemliydi. Çözelti içinde IBPs, bir buz kristalinin maruz kalma süresi kristali (kristal burst) etrafında buz ani büyüme kadar kristal oluşumu gelen zaman aralığı (erime işleminin sonunda) olarak tanımlanır. Biz IBPs için buz kristallerinin pozlama süresi önemlisi TH aktivitesini etkilediği belirlenmiştir. IBP pozlama (birkaç saniye) kısa dönemler Mp IBP-GFP çözeltisi (2.4 uM) (Şekil 5), düşük TH aktivitesi üretti. Bu 4 dk IBP pozlama bir platoya ulaştı kadar TH aktivitesi IBP pozlama süresi artmıştır. Yüksek IBP konsantrasyonlarda, plakaau kısa zamanlarda ulaşılmıştır.
Şekil 1. Şematik gösteren IBPs buz adsorbe. 10 izni ile benimsendi.
Şekil 2. Soğuma evresi. A) mikroskop tüpler bağlandı. B) Üst kurşun olmadan. C) şematik diyagramı.
Şekil 3. LabVIEW arayüzü ekran görüntüsü. Clbüyük bir rakam görmek için buraya Ick.
Şekil 4. Sıcaklık stabilitesi grafiği. Sıcaklık kontrol sıcaklığı 0.01 ° C, 15 sn düşürmek için kurulmuştur.
Şekil 5. IBPs buz kristali kalma süresinin bir fonksiyonu olarak Mp IBP TH aktivitesi. Her zaman noktasında 3-6 deneylerin ortalamasıdır.
Discussion
Bu çalışma olağanüstü ısı kontrolü ile TH aktivitesinin doğru ölçümleri mümkün kılar bir bilgisayar kontrollü nanolitre Ozmometre çalışmasını gösterir. Herhangi bir sıcaklık duyarlı sisteminde, istenmeyen sıcaklık değişimleri kaçınılmalıdır. Burada sunulan cihaz içinde sıcaklık gradyanları önlemek için, test çözeltisi damla bakır disk soğuma evresi (adım 2.7) içinde bir deliğin merkezi olarak konumlandırılmış olmalıdır. Ayrıca, tek bir kristal damlacık merkezinde ziyade kenarlarına yakın olmalıdır (çoğu durumda, bu kendiliğinden gerçekleşir). Açıklandığı zaman bağımlılığı soğutma hızı TH okumalarını etkiler olabileceğini gösterir. Böylece, kristal soğutma önce çözelti maruz kaldığı süreyi bir rapor, hem de soğutma hızı dahil olmak üzere göstermektedir. Biz genellikle 0.01 sıcaklık aşağı Ramping önce 10 dakika bekledi ° C her 4 sn adımlar.
LabVIEW kontrollü işbirliğioling aşama microfluidic cihazlar termal olarak manipüle edilebilir, üzerinde bir ters mikroskop ile kullanım için adapte edilmiştir. Bu sistem eGFP, 9, 10, 16 ile etiketlendi buz kristalleri ve IBPs içeren çözelti değiş tokuş deneylerin yapılması kolaylaştırır. LabVIEW kontrollü sistem belirli bir uyum elektrik devresi yoluyla 3.040 sıcaklık kontrol bağlayarak bir Clifton aşama için adapte edilebilir. Böyle bir sistem, Davies laboratuvar 17 işletilmektedir. LabVIEW yazılım ve Clifton aşaması için belirlenen adapte elektrik devresi tasarımı istek üzerine mevcuttur.
Sonuç olarak, hassas kontrol ve manipülasyon sıcaklık ve gerçek zamanlı analiz için LabVIEW rutin yoluyla bir video arayüzü ile koordineli sıcaklık artış ve azalış oranı (0.002 ° C hassasiyet ile), kolaylaştıran bir nanolitre Osmometer açıklar. Bu sistem importan vardır tekrarlanabilir hızı kontrollü deneyler gerçekleştirebilirsinizbuz ile IBP etkileşimlerinin kinetik araştırmak için t. Bu tür deneyler IBPs etki mekanizması çevreleyen birkaç uzun zamandır tartışılan sorunları ele alabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma ISF, NSF ve ERC tarafından desteklenmiştir. Biz Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, ve Jeremy Dennison sıcaklık kademesi ile teknik yardım kabul etmek istiyorum. Yazılım geliştirme ile Yardımlaşma Veya Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy ve Sumit Bhattachary tarafından sağlanmıştır. Biz Mp IBP protein ve yararlı tartışmalar için ortak Prof Peter L. Davies ve Dr Laurie A. Graham teşekkür etmek istiyorum. Biz de teşekkür laboratuar üyeleri Dr Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr Yeliz Çelik, Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy ve kendi kullanıcı geri bildirimleri için Shlomit Guy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
