Summary
冰结合蛋白（IBPS），也被称为抗冻蛋白，抑制冰的生长及组织的冷冻保存中使用的是一个有希望的添加剂。调查IBPS使用的主要工具是纳升渗压计。我们开发了一个设计的冷却阶段安装在光学显微镜和控制使用一个自定义内置的LabVIEW常规。这里所描述的纳升渗压计在一个超灵敏的操纵样品的温度。
Abstract
冰结合蛋白（IBPS），包括抗冻蛋白，冰结构蛋白，热滞蛋白，冰结晶抑制蛋白，被发现在冷适应的有机体，并保护它们与冰晶冷冻损伤。 IBPS被发现在各种有机体，包括鱼1， 植物2，3，节肢动物4，5 6，真菌和细菌7。 IBPS吸附到冰晶体的表面，并防止水分子从加入冰格在IBP吸附位置。制冰上生长的晶体表面之间的吸附IBPS开发高曲率，降低温度，在该温度下的冰晶体的成长，作为为Gibbs-Thomson效应提到的现象。此抑郁创建的熔点和冰的生长，在其内被逮捕8-10，参见图1的非平衡凝固点之间的间隙（热滞后，TH）。上IBP研究中使用的主要工具是e的纳升渗压计，这有利于测量TH活动的IBP解决方案。纳升渗压计，如克利夫顿仪器“（克利夫顿技术物理系，哈特福德，纽约州）和奥塔哥仪器”（奥塔哥渗压计，达尼丁，新西兰），设计用于测量溶液的渗透压测量的熔点抑郁症的液滴纳升卷。这些设备被用来测量生物样品，如眼泪11的渗透压，并在IBP研究发现是有用的。这些纳升渗压计的手动控制限制了实验的可行性。温度变化率的变化，无法可靠地进行控制，克利夫顿仪器的温度范围内被限制到4000毫渗透摩尔（约-7.5℃），并作为时间的函数的温度记录这些仪器不是可用的选项。
我们设计了一个特制的计算机控制的南欧力特渗压计系统使用LabVIEW平台（美国国家仪器公司）。冷阶段，前面描述的9，10，包含一个金属块，水通过该循环，从而起到作为散热器，请参阅图2。附加到该块是可以使用商业的温度控制器，该控制器可以控制通过LabVIEW模块驱动的热电冷却器，请参阅图3。下面提供进一步的细节。该系统的主要优点是它的感温控制， 见图4。自动温度控制，允许一个固定的温度斜坡的协调与视频显微镜输出包含更多的实验细节。
研究TH活动与时间的关系，我们测试了58 kDa的多动IBP从南极的细菌Marinomonas primoryensis（MP IBP）12。这种蛋白质有利于增强型绿色荧光标记蛋白（EGFP）在一个结构开发的彼得·戴维斯组（皇后大学）10。我们发现，受影响的温度变化曲线TH活动。在这些实验中的温度分布的极好的控制显着改善了对TH测量。纳升渗压计，还使我们能够测试IBPS 5星，13的重结晶抑制。在一般情况下，重结晶是一种现象，其中大的晶体生长在牺牲小晶体大。 IBPS有效地抑制再结晶，即使在低浓度14，15。我们使用LabVIEW控制的渗压计，定量跟踪冰的再结晶和执行恒定的冰部分使用的同步实时视频分析的图像和温度反馈，从样品室13。实时计算提供了更多的控制选项，在实验过程中。倒置显微镜发展到一个阶段ccommodate温度控制的微流体装置，这将在其他地方描述16。
冷战阶段系统
冷阶段的组件（ 图2）包括一组热电冷却器，冷却铜板。热量被从阶段通过流动冷水通过一个封闭的室下的热电冷却器除去。 4毫米直径的孔，在中间的铜板作为观看窗口。直径1毫米的平面内孔，钻孔，以适应热敏电阻。甲量身定制的铜与几个孔（直径500微米）的光盘（7毫米的直径）的铜板上，并置于与观看窗口对齐。泵入空气的流速为35毫升/秒，并干燥，用燥石膏（华盛顿州哈蒙德）。使用的干燥空气，以确保干燥的环境中，在冷却阶段。该阶段是通过一个9针连接插座连接温度控制器（型号3040或3150，Newport公司尔湾，加利福尼亚州，美国）。温度控制器通过电缆连接到计算机的GPIB-PCI卡（美国国家仪器，奥斯汀，德克萨斯州，美国）。
Protocol
0。初步程序
- 玻璃毛细管中的溶液注入。，使用毛细管牵拉（成茂，东京，日本）中，准备一个尖锐的吸移管，具有细小开口的玻璃毛细管的微管（品牌GMBH，韦特海姆，德国）。的开口的大小应加以核实通过空气通过毛细管，得到细的干净的水鼓泡。如果毛细管被关闭，然后打开它，打破它的优势。这可以通过对水中含有管壁它轻轻地按压或刮伤。准备的毛细管，使得开口几乎是阻止，但被充分地打开，以允许亚毫米的气泡的形成。
- 铜光盘清洁。超声波清洗铜光盘在0.1％微-90肥皂（Cole-Parmer公司，弗农山，伊利诺斯州，美国）的10分钟，然后用双蒸水清洗。异丙醇（技术）解决方案和介绍光盘，再次超声处理10分钟。鳍盟友，干燥的光盘使用过滤后的空气。这个清洁阶段中是至关重要的，以避免的IBP污染之间实验。
- 双层玻璃罩装配，一个玻璃罩装配，准备让无盖玻璃表面的水分冷凝样品的观察。这是通过两个盖玻片上，然后将胶与热胶枪之间放置一个燥石膏（WA哈蒙德燥石膏，捷尼亚，俄亥俄，美国）颗粒（直径2 mm）。这种配置防止冷凝，当样品被冷却至低温并除去吹干燥空气中的观察窗上的需要，可以阻止视图。
1。冷却阶段，
- 在冷却阶段的水的流入口和出口连接到4毫米内径的Tygon管（圣戈班，巴黎，法国），和水流入口管连接到一台水泵。
- 一个4毫米内径的Tygon管连接到入口的冷却阶段tØ提供干燥的空气。的空气干燥使用一个在线燥石膏列。
- 操作空气和水的泵。请注意，冷却的元素不应该被未经散热器运行。
- 打开温度控制器，摄像头，和LabVIEW常规。
2。样品制备
- 放置浸油B（0.0004实验室锡达格罗夫，新泽西州，美国）上的背面侧的直径7mm的铜盘具有500μm的钻孔通过盘3-4微升液滴。
- 铜盘定位面朝下浸油的冷却阶段。
- 连接的毛细管（钝缘）0.7毫米内径的Tygon管的另一端连接到一个2毫升玻璃的注射器（Poulten-格拉夫，韦特海姆，德国）。
- 使用毛细管之前，检查所述毛细管的小开口，以确保该开口是一个适当的大小（见初步的程序）。
- 慢慢地将冰川SS毛细管进入准备IBP蛋白质样品管（2.4μM的熔点 IBP-GFP在20mM的CaCl 2和25mM的Tris-HCl在pH值为8，用于制备细节，见参考文献10）和拉玻璃注射器，直到玻璃毛细管含有0.1微升的蛋白质溶液。
- 通过LabVIEW软件，开始录像记录。
- 的玻璃毛细管（含蛋白质溶液）成铜光盘上的冷却阶段中的孔之一插入的锋利边缘。
- 当通过显微镜观察（奥林巴斯，日本，东京，10x物镜），小心地渗透层与玻璃毛细管尖端的浸油，并按下的玻璃注射器（非常微妙），以提供一个小的量的蛋白质（〜10 nl）的解决方案来创建一个200微米的液滴。
- 在冷却阶段组件（见初步程序）与双层盖玻片覆盖孔。
3。 TH活性的测定
- 前SS的冷却按钮，设定温度为-40°C。
- 最初，该溶液液滴将被清除。在低温下，通常在-30℃至-35℃下，液滴的颜色会发生变化，这表明该溶液已被冻结。样品后立即冻结，慢慢地提高温度，直到大量的冰开始融化。的温度会逐渐增加是必要的，以避免过冲的，可能会导致在完全熔化的样品的温度。
- 切换到50倍的目标，并通过调节温度开始融化的冰。这种调整是交互式的，0.002℃，用小的温度的步骤，通常执行的最后步骤继续融化，直到单晶仍然存在。晶体的最终大小应该是大约10微米。的最高温度，在该温度下熔化已不再被确定为熔点，并精确地确定在购买的视频分析阶段。 <李>把温度设置为几百分之一摄氏度的熔点以下的晶体，并用10分钟的延迟开始的温度斜坡。调整所需的升温速率。在这段时间内，晶体将被暴露的IBPS。
- 完成后的10分钟的曝光时间，温度会的LabVIEW例程的控制下，自动降低。
- 观察晶体形状随着温度的降低。在某些时候，突然一阵冰晶可以观察到。注意到作为晶体突发温度的温度，在这温度下，发生这种情况。
- 使用视频分析，以确定准确的熔点和脉冲串的温度。首先，通过使用视频分析，找到准确的熔点。回想一下，最高温度，在该温度下熔化已不再被确定为熔点。记下这个熔点在电子表格程序。然后，确定准确的结晶的爆破温度，并记录该值为好。的熔点和冰点，或晶体突发温度之间的差异是的IBP溶液的热滞后活性。
4。的依赖于时间的TH活动测量
- 按照协议第3.1-3.3准备一个冰晶体。
- 晶体形成后，设定所需的延迟时间的坡道，以及打开的坡道上。
- 温度将降低固定利率（根据运营商的要求）后，自动坡道延迟时间已经过了。
- 记录的晶体突然发生的温度，在该温度下。计算的曝光时间（晶体的形成和晶体的脉冲串之间的时间）。
- 重复实验，不同的延迟时间，和作为曝光时间的函数绘制的TH活性评估TH活性的时间依赖性。
Representative Results
测量TH时间依赖性
LabVIEW的操作纳升渗压计，有利于性能测量准确TH的活动。恒定的温度降低率允许的TH的时间依赖性的测量。精确的温度控制使能纳升渗压计，这些实验是至关重要的。冰晶体在溶液中的IBPS的曝光时间被定义为形成的晶体（熔化过程的结束）的时间周期从直到周围的冰晶体（晶体突发）的突然增长。我们发现，曝光时间的冰晶体的IBPS关键影响TH活性。短时间的的IBP曝光（几秒钟）生产的低TH活动在 MP IBP-GFP溶液（2.4μM）（ 图5）。 TH活性增加与IBP曝光时间，直到它到达一个高原在4分钟IBP曝光。在较高的初馏点浓度，该板非盟在较短的时间内达到。
图1的示意图示出IBPS吸附到冰。通过许可10。
图2的冷却阶段。 A）连接到管显微镜。 B）没有上引线。 C）示意图。
图3。的LabVIEW界面的屏幕截图。 氯ICK这里查看大图。
图4的温度稳定性的图。该温度控制器被设置为较低的温度0.01°C每15秒。
图5， 熔点 IBP TH活性作为冰晶曝光时间的函数的IBPS。每个时间点是3-6次实验的平均值。
Discussion
这项工作表明操作的计算机控制的纳升渗压计的TH活性具有非凡温度控制，使精确的测量。在任何温度敏感的系统中，必须避免不必要的温度梯度。为了避免在这里提出的装置中的温度梯度，在测试溶液液滴必须被定位在铜圆盘冷却阶段（步骤2.7）中的孔的中心。此外，单晶应该是在液滴的中心，而不是靠近边缘（在大多数情况下，这会发生自发）。描述的时间依赖关系表示的冷却速率可能会影响对TH读数。因此，我们建议包括一个报告的时间，在此期间，晶体被暴露到该溶液中，在冷却之前，以及冷却速度。通常，我们等了10分钟前，斜坡下降的温度为0.01°C步骤，每4秒。
LabVIEW的控制合作适于使用倒置显微镜，微流体装置可热操纵oling阶段。此系统有利于涉及冰晶和eGFP的9，10，16具有标记IBPS溶液交 换实验的性能。 LabVIEW的控制系统可适于到克利夫顿阶段通过连接3040通过一个指定的自适应电路的温度控制器。这样一个系统的操作在戴维斯的实验室17。 LabVIEW软件和指定的克利夫顿阶段的适应电路设计可应要求提供。
总之，我们描述了纳升渗压计，有利于敏感的控制和操作的温度和温度的升高和降低的速度（0.002°C灵敏度），配合视频接口，通过LabVIEW的程序进行实时分析。该系统可以进行重复的速率控制实验，是的importan调查IBP与冰相互作用的动力学吨。这样的实验可以解决一些长期争论的问题IBPS行动的机制。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由ISF，NSF，和ERC。我们要感谢技术帮助，兰迪·米尔福德，迈克尔·科伦，道格·谢弗和杰里米·丹尼森的温度阶段。或陈，徐迪，拉杰什Sannareddy，和SUMIT Bhattachary与软件开发提供了援助。我们要感谢我们的合作者教授彼得·戴维斯博士和劳瑞A.格雷厄姆的熔点的 IBP蛋白质和有益的讨论。我们也感谢实验室成员玛雅酒吧DOLEV，扬中市秦，Yeliz切利克博士，博士纳塔利娅Pertaya，Ortal Mizrahy，并为他们的用户反馈Shlomit盖伊博士。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
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