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Medicine

Imagerie gliome Initiation doi: 10.3791/4201 Published: November 20, 2012
* These authors contributed equally

Summary

En combinant une poli et renforcé vulnérabilité de la victime (ports) crânienne injection fenêtre et le glioblastome cellule (GBM), on peut observer l'initiation gliome et la croissance des cellules de glioblastome injectées dans le cerveau d'une souris vivante longitudinalement.

Abstract

Le gliome est l'une des formes les plus mortelles de cancer chez l'homme. La thérapie des gliomes la plus efficace à ce jour, la chirurgie suivie de radiothérapie au traitement offre aux patients que des avantages modestes, comme la plupart des patients ne survivent pas plus de cinq ans après le diagnostic en raison d'une rechute de gliome 1,2. La découverte des cellules souches cancéreuses dans les tumeurs cérébrales de l'homme promet d'avoir un impact énorme sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le gliome 3. Les cellules souches cancéreuses sont définis par leur capacité à la fois à se renouveler et de se différencier, et sont pensés pour être les seules cellules dans une tumeur qui ont la capacité d'initier de nouvelles tumeurs 4. Gliome rechute après une radiothérapie est considéré comme provenant de la résistance des cellules souches de gliomes (CSS) à la thérapie 5-10. In vivo, les CSS sont présentés à résider dans une niche périvasculaire qui est important pour le maintien de cellules souches de leurs caractéristiques telles que 11-14 . Au centre de l'orgation de la niche CGC sont les cellules endothéliales vasculaires 12. Les preuves existantes suggèrent que les CSS et leur interaction avec les cellules endothéliales vasculaires sont importants pour le développement des tumeurs, et d'identifier les CSS et leur interaction avec les cellules endothéliales comme d'importantes cibles thérapeutiques pour les gliomes. La présence de CSS est déterminée expérimentalement par leur capacité à initier de nouvelles tumeurs sur la transplantation orthotopique 15. Cette opération est généralement réalisée par injection d'un nombre spécifique de cellules isolées à partir de GBM tumeurs humaines dans le cerveau de gravement immunodéprimés, souris ou des cellules de glioblastome souris dans le cerveau des souris congéniques d'accueil. Les tests pour la croissance des tumeurs sont ensuite effectuées après le temps suffisant pour permettre CSS entre les cellules de glioblastome injectés pour donner naissance à de nouvelles tumeurs, généralement plusieurs semaines ou mois. Par conséquent, les tests actuels ne permettent pas l'examen de l'important processus pathologique de l'initiation des tumeurs de CSS unique in vivo. Par conséquent, essentiel insights dans les rôles spécifiques des CSS et de leur interaction avec les cellules endothéliales vasculaires dans les premières étapes de l'initiation des tumeurs font défaut. De telles idées sont essentiels pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les gliomes, et aura des répercussions importantes pour la prévention de la rechute de gliome chez les patients. Ici, nous avons adapté les ports procédure de fenêtre crânienne 16 et in vivo microscopie à deux photons pour permettre la visualisation de l'initiation tumorale des cellules de glioblastome injectées dans le cerveau d'une souris vivante. Notre technique permet de préparer le terrain pour les futurs efforts visant à élucider les mécanismes clés de signalisation entre les CSS et les cellules endothéliales vasculaires lors de l'initiation du gliome.

Protocol

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1. Protocole

  1. Anesthésier la souris avec la kétamine et de xylazine à une dose de 0,1 mg de kétamine et de xylazine 0,01 mg par 1 g de poids corporel. Carprofène (0,005 mg par 1 g de poids corporel) est utilisé pour l'analgésie et est administré avant l'opération.
  2. Tous les outils chirurgicaux, y compris la mèche dentaire, sont stérilisés à la vapeur dans un autoclave. Si chirurgies lots doivent être effectués, les pointes des instruments chirurgicaux doivent être stérilisés avec un stérilisateur à billes de verre (Fine Outils scientifiques FST 250) avant chaque intervention chirurgicale ultérieure.
  3. Une fois que la souris a atteint un plan chirurgical de l'anesthésie, évaluée par l'absence d'une réponse à un pincement de l'orteil, il est placé sur un tampon de coton qui est ensuite placé sur un coussin chauffant pour maintenir une température corporelle de 37 ° C ~ La profondeur de l'anesthésie est contrôlé fréquemment pendant la chirurgie.
  4. Fourrure est retiré de la tête dorsal dans une zone à peu près triangulaire ~ 3 mm caudal dans les narines et s'étendant caudalement à la CErvical vertèbres. Pommade ophtalmique est appliqué sur les yeux pour les protéger de la déshydratation et l'irritation.
  5. La souris est placée dans décubitus ventral et la peau est désinfectée avec de l'iode chirurgical, de l'éthanol 70%, et des tampons stériles. Un lambeau 0,8 x 1,0 cm de peau qui recouvre la face dorsale de l'os frontal et pariétal du crâne est retiré à l'aide de ciseaux fins.
  6. Un analgésique topique, 0,5% de lidocaïne, est appliqué localement sur le périoste et les tissus exposés à la périphérie de la blessure. Le périoste est enlevé en grattant doucement le crâne avec une lame de scalpel, ce qui permettra à la colle cyanoacrylate d'adhérer à l'os.
  7. La zone corticale d'intérêt est décrite sur le crâne avec un marqueur. La zone d'intérêt ne doit pas être située au-dessus des lignes de suture du crâne, pour éviter d'endommager les gros vaisseaux sous-jacents.
  8. Une fine couche de colle cyanoacrylate est appliqué sur les bords de la plaie, pour empêcher l'infiltration de fluide sérosanguin, et à l'exception de crânela zone d'intérêt.
  9. Activé par la lumière de ciment dentaire est utilisé dans notre protocole pour assurer l'étanchéité de la boîte crânienne. Avant l'application du ciment dentaire, tous crâne exposé à l'exception de la zone prévue pour l'éclaircissage est traitée avec des amorces et ensuite avec l'agent de liaison du kit activé par la lumière du ciment dentaire. Une fois l'agent de liaison est séché, le ciment dentaire activé par la lumière est appliquée pour couvrir le crâne. Pour stabiliser la tête de la souris pour la chirurgie et l'imagerie par suite, une solution stérile # 00-90 écrou hexagonal est incorporé dans le ciment dentaire à distance de la zone à être éclaircis. L'utilisation de la lumière activé par du ciment dentaire nous permet de préparer le crâne sans avoir à se précipiter pour terminer la procédure. Une fois la préparation du ciment dentaire sur le crâne est terminée, le ciment dentaire est durcie par la lumière visible.
  10. Après que le ciment dentaire est durcie, un support de pièce de tête du dispositif de stéréotaxie est monté sur l'écrou hexagonal sur la tête de la souris à l'aide d'une vis # 00-90.
  11. A drop de la température ambiante, 0,9% de solution saline stérile est appliqué sur la surface du crâne à amincir. À l'aide d'un stéréomicroscope, d'un haut débit de micro-perçage est utilisée pour diluer une zone circulaire de la boîte crânienne (typiquement ~ 4-5 mm de diamètre) au-dessus de la région d'intérêt. Forage et l'application d'une solution saline à la surface forés sont effectuées de façon intermittente au cours de la procédure d'amincissement pour éviter une lésion thermique du tissu sous-jacent cérébrale. Saline absorbe la chaleur et contribue également à adoucir l'os.
  12. Le crâne souris comprend deux couches minces d'os compact, prenant en sandwich une couche d'épaisseur de l'os spongieux. La couche externe de l'os compact et plus de l'os spongieux sont enlevées à l'aide de la perceuse.
  13. Après que la majorité de l'os spongieux est supprimé, les cavités restantes dans l'os spongieux peut être vu sous un microscope à dissection, indiquant que le forage se rapproche de la couche d'os compact interne. A ce stade, l'épaisseur du crâne doit toujours être supérieure à 50 um. Crâne éclaircie doit êtrecontinué soigneusement pour obtenir une préparation très mince (~ 20 m) et lisse.
  14. Une fois l'épaisseur désirée est atteinte du crâne (~ 20 mm), le crâne est d'abord polie à l'aide d'un fouet en silicone sur mesure à la pâte diamantée (6-15 um) pendant environ 10 min. Le polissage de diamants pâte sert à deux fins. Tout d'abord, il amincit davantage le crâne sans appliquer de pression sur le crâne aminci, évitant ainsi les dommages accidentels au tissu cérébral sous-jacent. Deuxièmement, elle sert d'étape de polissage initial pour le crâne amincie avant l'oxyde d'étain fine est utilisée pour le polissage crâne plus loin.
  15. Après le polissage de diamants pâte, le crâne amincie est polie avec l'oxyde d'étain pendant environ 10 min. Une fois que le crâne est poli, l'oxyde d'étain est rincé loin avec une solution saline jusqu'à ce que le crâne aminci semble propre.
  16. À cette étape, si la fenêtre crânienne doit être utilisé pour l'imagerie in vivo longitudinale, la surface du crâne mince nettoyé est séché. Une petite goutte de clairecolle cyanoacrylate est appliqué pour sceller la fenêtre crânienne. La couche de colle cyanoacrylate entre le crâne amincie et la lamelle doit être aussi mince que possible.
  17. Si une injection doit être effectuée après la création d'une fenêtre ports crânienne, à cette étape, une aiguille de seringue de calibre 26 est utilisé pour créer une petite ouverture sur un côté de la lame mince polie-crâne fenêtre. Cette ouverture est utilisée pour l'injection de cellules GBM.
  18. Une pipette en verre stérile avec une pointe d'ouvrir environ 50 um de diamètre est tiré à l'aide d'un extracteur de pipette. Cette pipette est utilisée pour l'injection de cellules GBM, et est chargée sur un micromanipulateur. La pipette est chargée à un angle de 30 degrés afin que le site d'injection de cellules GBM sera loin du site final d'imagerie. La pointe de la pipette est éliminé sous un microscope à dissection. La suspension de cellules GBM est à chargement frontal dans la pipette par aspiration à l'aide d'une seringue.
  19. Une fois la pipette d'injection est chargé avec des cellules de glioblastome, la souris est déplacé en arrière sous eMicroscope électronique. La pipette d'injection est abaissé vers la petite ouverture dans la fenêtre crânienne et finalement introduite dans le cerveau à travers l'ouverture à l'aide d'un micromanipulateur. 1 pi d'une suspension de cellules GBM est injecté dans les 100-200 um cerveau de la surface du cerveau (vitesse: 0,1 l / min, durée: 10 min).
  20. Le crâne est séché, une petite goutte de colle cyanoacrylate transparent est appliqué sur le crâne sec, et un morceau de 3 mm de taille n ° 1 lamelle est collée à la zone de vulnérabilité de la victime et poli. L'espace entre la lamelle et adjacente ciment dentaire est scellé avec de la colle cyanoacrylate.
  21. Après la chirurgie, la souris est injecté par voie sous cutanée avec 1 ml de solution saline stérile chaude et muni de chauffage d'appoint pour maintenir la température du corps jusqu'à guérison complète de l'anesthésie.
  22. Pour l'imagerie, les souris sont anesthésiées avec de la kétamine et de xylazine à la dose de 0,1 mg de kétamine et de xylazine 0,01 mg pour 1 g de poids corporel. Les souris sont immobilisés à l'aide d'un cadre stéréotaxique personnaliséesous le microscope. Si répétitif imagerie in vivo est effectuée sur une base quotidienne, isofluorane sera une meilleure option, car les souris présentent des signes de dépendance à l'utilisation répétitive de la kétamine.

2. Les résultats représentatifs

Une chirurgie réussie ports fenêtre crânienne permet à la fenêtre crânienne rester à l'écart pendant des semaines ou des mois. La figure 1 montre la vascularisation sous une fenêtre ports crânienne visualisées en utilisant la lumière rétrodiffusée. Ces images vasculaire ont été utilisés comme points de repère pour localiser les mêmes aires cérébrales pour l'imagerie répétitive. Pour visualiser à la fois les cellules endothéliales et les cellules du système vasculaire GBM, nous avons traversé la B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J souris, qui marque les cellules endothéliales vasculaires avec le B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J souris et souris générés par les cellules endothéliales vasculaires étiquetés avec la protéine fluorescente rouge tdTomato. Nous avons ensuite effectué la procédure craniotomie sur ces ports kmCE, et injecté GFP cellules marquées GBM dans leur cerveau à travers une petite ouverture sur le côté d'une fenêtre crânienne. Nous avons ensuite effectué in vivo d'imagerie à deux photons longitudinalement sur ​​les souris injectées. La longueur d'onde d'excitation laser a été fixée à 910 nm, ce qui a entraîné à la fois l'excitation de la GFP et tdTomato. Imagerie biphotonique a été réalisée sur un custom-built deux photons microscope à balayage laser avec deux détecteurs pour la capacité de détection simultanée vert / rouge fluorescence. Figure 2 montre un exemple de gliome in vivo de l'initiation à partir de cellules de glioblastome injecté près de la vascularisation. La fenêtre ports crânienne est également un excellent choix pour les maladies chroniques time-lapse imagerie in vivo. La figure 3 montre une coloration GFAP des sections corticales provenant d'une souris sans chirurgie ports, une souris 7 jours suivant la chirurgie ports, et une souris 7 jours après la chirurgie et les ports injection de solution saline. Il est évident à partir des images que la souris sans chirurgie et de la souris avec PoRTS chirurgie n'ont pas gliose, alors que suite à l'injection saline, gliose est observée dans les tissus du cerveau de la souris, en raison de la pénétration et pipeter injection de sérum physiologique dans le cerveau. Ce résultat démontre que la gliose ne se produit pas sous la fenêtre crânienne ports, fournissant une validation indépendante que les ports fenêtre crânienne décrites ici ne conduit pas à la gliose qui est généralement associée à un "crâne ouvert" fenêtre chronique crânienne. La figure 4 montre à haute résolution imagerie des épines dendritiques de la même souris sur le jour de l'intervention (jour 0) et 32 jours après la création de la fenêtre Ports (Jour 32), ce qui démontre que la fenêtre des ports est également un excellent choix pour haute résolution d'imagerie in vivo.

Figure 1
Figure 1. Visualisation de la vascularisation sous une fenêtre crâne aminci poli et renforcé crânienne en utilisant la lumière rétrodiffusée. Jours représentent t il certain nombre de jours après la chirurgie, les images ont été prises à partir du jour de l'opération immédiatement après l'achèvement de l'injection de cellules GBM. Barre d'échelle:. 0,5 mm Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Visualisation des cellules injectées GBM et vasculaire in vivo. Les souris portant à la fois Tek-Cre et ROSA26 CAG-tdTomato ont été utilisées pour l'injection de cellules GBM. Les cellules endothéliales vasculaires ont été marquées avec tdTomato (rouge), et les cellules de glioblastome ont été marquées avec la GFP (green). Les images ont été acquises à partir de 24 heures après l'injection de cellules GBM. Un total de 10-12 champs adjacents de vue ont été prélevés et ont été assemblés côte à côte, avec les cellules identifiées GBM injecté dans le centre du champ total, pour produire les images finales. Jours représentent le nombre de jours après la chirurgie. Barre d'échelle: 100 um.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 3
Figure 3. Gliose ne se produit pas après une chirurgie ports fenêtre crânienne. Panneaux supérieurs: section coronale du cerveau de la souris sous faible grossissement. Panneau de gauche: une souris sans chirurgie fenêtre crânienne; aucune activation GFAP est observée dans le tissu cérébral. Panneau du milieu: une souris avec une fenêtre crânienne ports généré sur le côté droit du cerveau; aucune activation GFAP est observée dans le tissu cérébral. Panneau de droite: une souris avec une fenêtre crânienne ports et injection de solution saline sur le côté de la fenêtre de ports. Activation GFAP est observé sur le côté de la fenêtre ports, mais pas sur le côté du tissu cérébral intact. Barre d'échelle: 1 mm. Panneau inférieur: plus grande puissance des images des tissus du cerveau dans les zones comme indiqué dans la case blanche des images supérieure du panneau. Barre d'échelle: 100 um.

Figure 4
Figure 4. Imagerie haute résolution des épines dendritiques de souris Thy-1 YFPH. Les images ont été acquises le jour de la chirurgie ports, et 32 ​​jours après la chirurgie ports. Il est évident à partir des images que la plupart des épines présentent au jour 0 sont clairement visibles 32 jours après la chirurgie ports. Barre d'échelle: 2 um.

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Discussion

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La clé de la réussite d'une fenêtre ports crânienne est l'amincissement et le polissage. Alors que la première éclaircie peut être réalisée rapidement, des précautions doivent être prises pour assurer homogène amincissement du crâne sur une grande surface. En général, nous appliquer une fine couche de solution saline pour le crâne, puis mince du crâne une passe à un moment, de sorte que la solution saline s'évapore peu de temps après la micro-foret a passé au-dessus du crâne une fois. Cela nous permet lentement mais de façon homogène mince supplémentaire du crâne. Une main ferme sous le microscope est également essentielle. Une fois crâne se rapproche de l'amincissement de l'épaisseur voulue, nous utilisons normalement pâte de diamant à polir le crâne éclairci pendant 10-15 min, avec un polissage ultérieur en utilisant l'oxyde d'étain. Nous constatons que le polissage du crâne dilué d'abord avec la pâte diamantée donne un meilleur résultat de polissage en général, et nous permet aussi de poursuivre mince une grande surface de la zone du crâne sans appliquer beaucoup de pression sur la zone du crâne amincie.

Nous avons choisi la cr portsanial fenêtre plutôt que d'autres fenêtres couramment utilisées crâniens, comme le "crâne ouvert" fenêtre et le "crâne aminci" fenêtre, pour les raisons suivantes: Avec la fenêtre ouverte du crâne, la fenêtre crânienne devient généralement nuageux peu de temps après la création, puis s'éclaircit sur elle-même dans les deux premières semaines, ce qui nécessite une période d'attente d'environ deux semaines avant que les expériences d'imagerie peut être effectuée. Cette carence de deux semaines la période empêcherait la visualisation de l'initiation gliome pendant les deux premières semaines après l'injection de cellules GBM. La fenêtre crâne aminci crânienne répétitive nécessite amincissement avant chaque séance d'imagerie, ce qui la rend impropre à l'injection de cellules GBM et la visualisation de l'initiation gliome sur une base quotidienne. En revanche, la fenêtre Ports nous permet d'effectuer l'injection de cellules GBM du côté de la fenêtre, ce qui minimise les dommages aux tissus du cerveau, et permet également la performance de la création d'imagerie à haute résolution qui suit immédiatement de la fenêtre. Information sur gliome initiation peut être recueilli dans les premières semaines suivant l'injection des cellules GBM, qui est un avantage important par rapport la technique crâne ouvert pour ce type d'études.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par le Grant Jackson Laboratory Cancer Center et The Pilot Fondation du cancer du Maine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate Thermo Sci Hyclone SH3026101
B-27 Serum Free Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
GlutaMax-1 Supplement Invitrogen 35050061
Penicillin-Streptomycin Solution Thermo Sci Hyclone SV30010
Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium eBioscience 00-4555-56
T25 flasks-vent cap green Sarstedt Ltd 83.1810.502
70% alcohol JAX LAHS
10% povidone-iodine topical solution JAX LAHS
Ketamine HCl Butler Animal Health Supply NDC# 11695-0550-1
Xylazine Akorn, Inc. NADA# 139-236
Carprofen JAX LAHS
Ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products 17033-211-38
0.5% Lidocaine HCl REGENT, Inc. NDC 0517-0625-25
Cyanoacrylate glue Henkel Corp 46551
Sterile Swabs Fisher Scientific 23-400-114
Diamond paste Widget Supply BBE60
Tin oxide LORTONE, Inc. 591-038
Liner Bond 2V KURARAY Medical Inc. 1921-KA
Clearfil AP-X KURARAY Medical Inc. 1721-KA
Saline JAX LAHS
Cover glass Warner Instruments 64-0720
Hex Nut Small Parts, Inc. HNX-0090-C
Syringe Pump Syringepump.com NE-1000
Two-Photon imaging system Custom built (Any commercial system would work)

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References

  1. Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
  6. Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
  7. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
  8. Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
  9. Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
  10. Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
  11. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
  13. Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
  14. Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
  15. Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
  16. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
Imagerie gliome Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Grâce à une poli et renforcé mince crâne fenêtre crânienne
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Zhang, L., Lapierre, A., Roy, B., Lim, M., Zhu, J., Wang, W., Sampson, S. B., Yun, K., Lyons, B., Li, Y., Lin, D. T. Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window. J. Vis. Exp. (69), e4201, doi:10.3791/4201 (2012).More

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