Summary
광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.
Abstract
Glioma은 인간 암의 가장 치명적인 형태의 하나입니다. 날짜 수술에 대한 가장 효과적인 glioma 치료는 방사선에 의해 다음 대부분의 환자가 glioma 재발의 1,2에 의한 진단 후 5 년 이상 생존하지 않는 한, 환자에게 단 겸손한 이익을 치료 - 제공합니다. 인간의 뇌 종양에서 암 줄기 세포의 발견은 glioma 3 소설 치료 전략의 개발에 엄청난 영향을 미치고을위한 약속을 보유하고 있습니다. 암 줄기 세포는 자신의 능력 - 자기를 갱신하고 차별화 모두에 의해 정의되며, 새로운 종양 4 대를 시작하는 능력이 종양에서 유일한 세포가 될 것으로 생각됩니다. Glioma 재발 다음과 방사선 요법은 치료 glioma의 줄기 세포의 저항 (GSCs)에서 발생하는 것으로 생각됩니다 5-10. 생체에서 GSCs들은 줄기 세포와 같은 특성 11-14을 유지하는 것이 중요합니다 perivascular 틈새에 거주하는 표시됩니다 . organi의 핵심GSC 틈새의 zation은 12 혈관 내피 세포 수 있습니다. 기존 증거가 혈관 내피 세포와 GSCs와 상호 작용 종양 개발을 위해 소중하게 생각하고 있으며, glioma에 중요한 치료 목표로 내피 세포와 GSCs과 상호 작용을 확인하는 것이 좋습니다. GSCs의 존재는 orthotopic 이식 15시 새로운 종양를 시작하기 위해 자신의 능력에 의해 실험적으로 결정됩니다. 이것은 일반적으로 인간의 종양에서 심각하게 immuno-결핍 생쥐의 뇌, 또는 congenic 호스트 마우스의 뇌에 마우스 GBM 세포에 고립 GBM 세포의 특정 번호를 주입에 의해 달성된다. 종양 성장을위한 Assays는 다음 주입 GBM 세포 간의 GSCs 새로운 종양 - 일반적으로 몇 주 또는 몇 달을 야기 할 할 수 있도록 충분한 시간에 따라 수행됩니다. 따라서, 기존의 assays는 생체 내 단일 GSCs에서 종양 개시의 중요한 병리 과정의 시험을 허용하지 않습니다. 따라서, 필수 전종양 개시의 초기 단계에서 혈관 내피 세포와 GSCs과 상호 작용의 특정 역할에 nsights이 부족합니다. 이러한 통찰력은 glioma에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기위한 중요한 있으며, 환자 glioma의 재발을 방지하기위한 좋은 영향을 미칠 것입니다. 우리는 여기 포트에게 두개골 창 프로 시저 16 적응하고 생체에 두 광자 현미경은 살아있는 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포에서 종양 개시의 시각화를 허용 할 수 있습니다. 우리 기술은 glioma의 개시시 GSCs와 혈관 내피 세포 사이의 키 신호 메커니즘을 명료하게하다하는 미래의 노력의 길을 열어 것입니다.
Protocol
1. 프로토콜
- 0.1 MG의 케타민과 체중 1g 당 xylazine의 0.01 밀리그램의 복용량에서 케타민과 xylazine으로 마우스를 마취. Carprofen (체중 1g 당 0.005 밀리그램)이 진통제에 사용되며, preoperatively 관리합니다.
- 치과 드릴 비트를 포함하여 수술 도구, 모든 압력솥에 소독 증기 있습니다. 일괄 수술이 수행 할 경우, 수술 계기의 팁은 이후 수술 전에 유리 구슬 살균기 (정밀 과학 도구 FST 250)로 다시 소독해야합니다.
- 마우스가 발가락 핀치에 대한 응답의 부재로 평가 마취의 수술 비행기를 도달되면, 그 다음 ~ 37 ° C.의 체온을 유지하기 위해 온수 패드에 배치되어있는면 패드에 위치 마취의 깊이는 수술 중에 자주 모니터링된다.
- 모피는 대략 삼각 지역의 등쪽 머리 ~ nares에 꼬리 3mm에서 제거 CE에 caudally 연장됩니다rvical 척추. 안과 연고는 탈수와 염증에서 그들을 보호하기 위해 눈에 적용됩니다.
- 마우스는 복부 recumbancy에 배치되고 피부 외과 요오드, 70 % 에탄올 및 멸균 면봉으로 소독합니다. 두개골의 전두엽과 정수리 뼈의 등 측면을 다루는 피부의 0.8 X 1.0 cm 플랩은 고급 가위를 사용하여 제거됩니다.
- 국소 진통제, 0.5 % lidocaine은 상처 주변의 골막과 노출 된 조직에 로컬로 적용됩니다. 골막은 부드럽게 메스 블레이드 두개골을 스크랩에 의해 제거되며이 뼈를 준수 할 수있는 시아 노 아세틸렌 접착제를 도움이 될 것입니다.
- 관심 대뇌 피질의 영역은 마커와 두개골에 설명되어 있습니다. 관심 지역은 기본 대형 선박의 손상을 방지하기 위해, 해골 봉합 라인을 통해 찾을 수 없습니다.
- 시아 노 아세틸렌 접착제의 얇은 층을 제외하고 serosanguinous 유체의 누출을 방지하기 위해, 상처 여백에 적용하고, 두개골에있다관심 지역.
- 라이트 - 활성화 치과 시멘트는 두개골을 봉인 위해 우리 프로토콜에서 사용됩니다. 치과 시멘트의 적용 전에 썼음를위한 지역을 제외한 모든 노출 된 두개골은 프리 머와 함께하고 이후에 빛을 활성화 치과 시멘트 키트에서 접착제로 처리됩니다. 본딩 에이전트가 건조되면, 빛 활성화 치과 시멘트는 두개골을 충당하기 위해 적용됩니다. 이후 수술 및 이미징을위한 마우스의 머리를 고정하려면, 살균 # 00-90 헥스 너트는 얇게 할 지역에서 거리에있는 치과 시멘트에 포함되어 있습니다. 빛 활성 치과 시멘트의 사용은 우리가 전체 절차를 완료하려면 서두를 필요없이 두개골을 준비 할 수 있습니다. 두개골에있는 치과 시멘트 준비가 완료되면, 치과 시멘트는 눈에 보이는 빛으로 치료합니다.
- 치과 시멘트가 완치되면 stereotactic 장치에서 투구 홀더는 # 00-90 나사를 사용하여 마우스 머리에 진수 너트에 장착된다.
- 박사룸 온도의 조합, 0.9 % 멸균 생리는 얇게 할 두개골 지역에 적용됩니다. stereomicroscope의 도움으로 고속 마이크로 드릴은 관심 지역 이상 (직경 일반적으로 ~ 4-5mm) 두개골의 원형 영역을 막을하는 데 사용됩니다. 드릴링 및 교련 지역 생리의 응용 프로그램은 기본 대뇌 조직에 열 손상을 방지하기 위해 썼음 절차를 수행하는 동안 간헐적으로 수행됩니다. 생리는 열을 흡수하고 또한 뼈를 부드럽게하는 데 도움이됩니다.
- 마우스 두개골이 작은 구멍이 많은 뼈의 두꺼운 층을 sandwiching, 소형 뼈의 두 얇은 층을 포함한다. 소형 뼈와 해면질의 뼈 대부분의 외부 층은 드릴을 사용하여 제거됩니다.
- 작은 구멍이 많은 뼈의 대부분이 제거 된 후, 해면질의 뼈 내에 남아있는 구멍이 드릴은 내부 소형 뼈 층을 접근을 나타냅니다, 해부 현미경으로 볼 수 있습니다. 이 단계에서, 두개골의 두께는 아직 50 개 이상의 μm해야합니다. 해골 시닝이 있어야합니다매우 얇은 (~ 20 μm)와 원활한 준비를 얻기 위해주의 깊게 계속했다.
- 두개골의 원하는 두께가 (~ 20 μm) 달성되면 두개골이 먼저 약 10 분 동안 다이아몬드 페이스트로 맞춤 제작 한 실리콘 채찍 (6-15 μm)를 사용하여 연마합니다. 다이아몬드 붙여 넣기 연마는 두 목적을 제공합니다. 첫째, 더함으로써 기본 뇌 조직의 실수로 손상을 피 얇게 두개골에 압력을 적용하지 않고 두개골을 꺼야. 세밀한 주석 산화물은 더 두개골 연마에 사용되기 전에 둘째, 얇게 두개골에 대한 초기 연마 단계로 제공하고 있습니다.
- 다이아몬드 붙여 넣기 연마 후, 얇게 두개골은 약 10 분에 대한 주석 산화물을 연마하고 있습니다. 두개골은 광택이되면 얇게 두개골은 깨끗 나타날 때까지, 주석 산화물은 식염수 거리에 플러시됩니다.
- 두개골 창 생체 이미징에 세로 방향에 사용하는 경우이 단계에서, 청소 얇은 두개골 지역은 건조하고 있습니다. 맑은의 작은 드롭시아 노 아세틸렌 접착제는 두개의 창을 밀봉에 적용됩니다. 얇게 두개골과 coverslip 사이에 시아 노 아세틸렌 접착제의 층은 가능한 한 얇은해야합니다.
- 주사이 단계에서 포트 두개 창 생성 후 수행 할 경우, 26 게이지 주사기 바늘은 광택이 얇은 두개골 창 한쪽에 작은 구멍을 만드는 데 사용됩니다. 이 오프닝은 GBM 세포 주입에 사용됩니다.
- 직경 약 50 μm을 열 팁과 멸균 유리 피펫은 피펫을 끌어 당기는를 사용하여 당겨 있습니다. 이 피펫은 GBM 세포 주입에 사용되며, micromanipulator에로드됩니다. 피펫은 GBM 세포 주입 사이트가 최종 이미징 사이트에서 떠나있을거야 있도록 30도 각도로로드됩니다. 피펫의 팁은 해부 현미경 아래에서 제거됩니다. GBM 세포 현탁액은 주사기 펌프를 사용하여 흡입하여 피펫으로 전면로드됩니다.
- 주입 피펫은 GBM 세포로로드되면 마우스가 일에서 돌아 이동전자 현미경. 주입 피펫은 두개의 창에있는 작은 오프닝으로 낮아 마지막 micromanipulator를 사용하여 개구를 통해 뇌에 삽입됩니다. GBM 세포 현탁액 1 μl은 뇌 표면의 두뇌 100-200 μm (: 0.1 μl / 분, 소요 시간 : 10 분 속도)에 주입된다.
- 두개골은 건조하고 깨끗한 시아 노 아세틸렌 접착제의 작은 방울은 건조 두개골에 적용되며, 3 mm 크기의 # 1 coverslip의 한 부분이 얇고 광택이 두개골 지역을 준수하고 있습니다. coverslip과 인접한 치과 시멘트 사이의 공간은 시아 노 아세틸렌 접착제로 밀봉되어 있습니다.
- 수술 후, 마우스는 1 ML 따뜻한 멸균 식염수에 피하 주입되어 완전히 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 보충 열을 제공했습니다.
- 이미징를 들어, 마우스는 0.1 MG의 케타민과 체중 1g 당 xylazine의 0.01 밀리그램의 복용량에서 케타민과 xylazine과 anesthetized 있습니다. 마우스는 사용자 정의 stereotactic 프레임을 사용하여 고정 아르현미경으로. 생체 이미징의 반복이 매일 수행되는 경우 쥐의 케타민이 반복적 사용과 의존의 흔적을 보여줍니다로 isofluorane은 더 나은 옵션이 될 것입니다.
2. 대표 결과
성공적으로 포트 두개 창 수술은 두개골 창 개월 주 명확한 유지 할 수 있습니다. backscattered 빛을 사용하여 시각화 그림 1은 포트 두개 창 아래의 vasculature을 보여줍니다. 이 vasculature 이미지는 반복적 인 영상에 대해 동일한 뇌 영역의 위치를위한 랜드 마크로서 사용되었습니다. vasculature 내피 세포와 GBM 세포를 모두 시각화하기 위해, 우리는 B6.Cg-GT (로사) 26Sor tm9 (편대의 편대장-tdTomato와 혈관 내피 세포에 이름표를 B6.Cg-TG (테크-cre) 1Ywa / J 마우스, 교차 ) Hze / J 마우스, 그리고 붉은 색 형광 단백질 tdTomato으로 표시 혈관 내피 세포로 생성 마우스. 우리는 이러한 미의 포트 craniotomy 절차를 수행CE, 그리고 두개의 창 옆에있는 작은 오프닝을 통해 뇌에 GFP-라벨 GBM 세포를 주입했다. 우리는 주입 된 쥐에 길이 방향으로 두 광자 이미징 생체에서 수행. 레이저 여기 파장은 GFP 및 tdTomato 모두 여기에 결과 910 nm의에서 설정되었습니다. 두 광자 이미징은 동시 녹색 / 적색 형광 검출 기능을위한 두 탐지기로 맞춤식 두 광자 레이저 스캐닝 현미경에서 수행되었다. 그림 2는 vasculature 근처에 주입 GBM 세포에서 glioma의 개시의 생체 예에서 보여줍니다. 포트 두개 창은 또한 생체 이미징의 시간 경과 만성위한 훌륭한 선택이 될 것입니다. 그림 3 포트 수술없이 마우스 대뇌 피질의 섹션 GFAP 염색, 포트 수술 후 마우스 7 일 및 마우스 칠일 포트 수술 후 등을 보여줍니다 염분 주입. 이 이미지에서 마우스 해당 POR과 수술 및 마우스없이 드러난다TS 수술은 뇌에 침투하고 생리 주사를 피펫으로 인해, 생리 주사를 다음 반면, gliosis는 마우스의 뇌 세포에서 관찰되며, gliosis가 없습니다. 이러한 결과는 gliosis는 두개의 창은 여기에 설명 된 포트는 일반적으로 "열린 머리"만성 두개골 창에 연결된 gliosis로 연결되지 않는 독립적 인 검증을 제공하는 포트 두개 창에서 발생하지 않습니다 보여줍니다. 그림 4는 높은 해상도를 보여줍니다 포트 창은 또한 생체 영상의 고해상도을위한 훌륭한 선택입니다 시연 수지상 수술 당일에 동일한 마우스 (일 0)에서 쪽과 포트 창 생성 후 32일 (일 32)의 이미지.
그림 1. backscattered 빛을 사용하여 광택 및 강화 얇게 두개골 두개골 창문 vasculature의 시각화. 일 t를 나타냅니다 수술 후 일 그 번호를, 이미지는 즉시 GBM 세포 주입 완료 후 수술 당일부터 촬영 된 것입니다. 규모 바 :. 0.5 mm가 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 생체에 주입 GBM 셀 및 vasculature의 시각화. 테크 - Cre 및 ROSA26 편대의 편대장-tdTomato 모두를 들고 마우스는 GBM 세포 주입을 위해 사용되었습니다. 혈관 내피 세포는 tdTomato (빨간색)으로 표시했고, GBM 세포가 GFP (녹색)으로 표시되었습니다. 이미지는 GBM 세포 주입 후 24 시간을 시작 인수했다. 보기의 10-12 인접 분야의 총 촬영되었으며, 최종 이미지를 생성하는, 총 필드의 중심에서 확인 주입 GBM 세포와 함께 서로 인접 해 조립했다. 일 수술 후 일 수를 나타냅니다. 규모 바 : 100 μm.HREF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg"대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. Gliosis는 포트 두개 창 수술 후 발생하지 않습니다. 상단 패널 : 낮은 배율에 따라 마우스의 뇌 코로나 섹션을 참조하십시오. 왼쪽 패널 : 모든 두개골 창 수술을하지 않으면 마우스, 노 GFAP 활성화는 뇌 세포에서 관찰된다. 중앙 패널 : 뇌의 오른쪽에 생성 된 포트 두개 창에 마우스, 노 GFAP 활성화는 뇌 세포에서 관찰된다. 오른쪽 패널 : 포트 윈도우의 측면에서 포트 두개 창 생리 주사와 마우스. GFAP 활성화는 포트 창 옆에 관찰 있지만 그대로 뇌 조직의 측면에 있습니다. 규모 바 : 1mm. 낮은 패널 : 상단 패널 이미지의 흰색 상자에 표시된대로 영역에서 뇌 조직의 높은 전력 이미지. 규모 바 : 100 μm. 
그림 4. 고해상도 축복-1 YFPH 마우스에서 수지상 쪽의 이미지. 이미지는 포트 수술 당일에 인수하고, 32일 포트 수술 후했다. 그것은 대부분의 쪽은 하루에 제시되는 이미지에서 0 포트 수술 후 명확하게 볼 수 32일 아르 명백합니다. 규모 바 : 2 μm.
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Discussion
성공적으로 포트를 두개 창에 키는 숱이와 연마입니다. 시닝 초기 신속 수행 할 수 있지만,주의 넓은 지역에 걸쳐 두개골의 숱이 동질적인 보장하기 위해주의해야한다. 우리는 일반적으로 생리 식염수가 microdrill 한 번 두개골을 통해 통과 한 직후에 증발하는 등, 두개골에 생리의 얇은 층을 적용하고 얇은 두개골 원 패스 한 번에. 이것은 두개골 우리에게 느리지 만 homogenously 더 얇은 수 있습니다. 현미경으로 침착도 중요합니다. 두개골 - 시닝는 의도 두께를 가까워하면, 우리는 일반적으로 주석 산화물을 사용하여 이후에 연마와, 10-15 분에 대한 얇게 두개골을 연마하는 다이아몬드 붙여 넣기 사용합니다. 우리는 다이아몬드 페이스트로 먼저 얇게 두개골을 연마하는 것이 일반적으로 더 나은 연마 결과를 얻을 발견, 또한 우리가 얇게 두개골 지역에 많은 압력을 적용하지 않고 두개골 지역의 얇은 넓은 지역을 증진 할 수 있습니다.
우리는 포트 CR을 선택오히려 다음과 같은 이유로 이러한 "오픈 두개골"창 및 "얇게 두개골"창 등의 일반적으로 사용되는 두개의 창을보다 anial 창 : 오픈 두개골 창으로는 두개골 창은 보통 곧 생성 한 후 흐림된다하고 정리할 모든 영상 실험을 수행 할 수 있습니다 전에 자신의 첫 2 주 이내에 때문에 약 2 주 대기 기간을 필요로하는. 기간을 기다리는이 2 주 GBM 세포 주입 후 초기 2 주 동안 glioma의 개시의 시각화를 방지합니다. 매일 GBM 세포 주입과 glioma의 개시의 시각화하기에 적합 렌더링 각 이미징 세션 전에 숱이 반복 얇게 두개골 두개골 창 필요합니다. 반면, 포트 창은 우리가 뇌 조직의 손상을 최소화하고, 또한 윈도우의 고해상도 이미징 즉시 다음과 같은 창조의 성능을 수있는 윈도우의 측면에서 GBM 세포 주입을 수행 할 수 있습니다. INFglioma 개시에 ormation는 연구의 유형에 대한 개방 된 두개골 기술에 비해 장점입니다 GBM 세포 주입, 후 처음 몇 주 이내에 수령하실 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 잭슨 연구소 암 센터 파일럿 그랜트와 메인 암 재단이 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
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