يوصف طريقة محددة وحساسة لاكتساب نظرة ثاقبة في التعبير عن مستضدات الشخصي glycosphingolipid في أجهزة المناعة والخلايا. الأسلوب يستفيد من قياس الطيف الكتلي ايون فخ السماح تدريجي تفتيت جزيئات glycosphingolipid التحليل البنيوي للمقارنة معايير مركبة كيميائيا.
الشحميات السفنغولية السكرية (لGSL) تنتمي إلى فئة من الجزيئات الكبيرة الحيوية glycoconjugate، التي تحمل المعلومات الهيكلية للعمليات البيولوجية الهامة مثل التطور الجنيني، نقل الإشارة، والاعتراف المناعة مستقبلات 1-2. أنها تحتوي على السكر الأنصاف المعقدة في شكل أيزومرات، والأنصاف الدهون بما في ذلك مع وجود اختلافات الدهنية أسيل طول السلسلة، والتشبع، والهيدروكسيل. قد حد سواء الكربوهيدرات وسيراميد أجزاء تكون أساس الأهمية البيولوجية. على سبيل المثال، ثلاثي hexosylceramides تشمل globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) وisoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)، والتي لها الجماهير الجزيئية متطابقة ولكن الروابط السكر متميزة من الكربوهيدرات شاردة، مسؤولة عن الوظائف البيولوجية مختلفة تماما 3-4. وفي مثال آخر، فقد ثبت أن تعديل الجزء سيراميد ألفا galactosylceramide، ويجند ناهض قوية لinvariالنمل خلايا NKT، والتغيرات ملفاتهم الشخصية إفراز خلوى وظيفة في النماذج الحيوانية من السرطان وأمراض المناعة الذاتية 5. صعوبة في أداء التحليل البنيوي الايزومرات في أجهزة المناعة وخلايا بمثابة حاجز لتحديد العديد من الوظائف البيولوجية 6.
هنا، نقدم نسخة من تصور طريقة لتحليل بسيطة نسبيا وسريعة، وحساسة لمحات glycosphingolipid في الخلايا المناعية 7-9. ويستند هذا الأسلوب على التعديل واستخراج الكيميائية (permethylation، وانظر أدناه 5A الشكل، استبدال جميع الفئات OH من هيكسوز بواسطة ميو بعد رد فعل permethylation) من الشحميات السفنغولية السكرية 10-15، تليها التحليل اللاحق باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت من على متن الطائرة قياس الطيف الكتلي (MALDI-TOF/MS) ومطياف الكتلة ايون الفخ. هذه الطريقة تتطلب 50 مليون خلية المناعة لإجراء تحليل كامل. ويمكن الانتهاء من التجارب في غضون أسبوع. ويمكن تحديد الوفرة النسبية للالشحميات السفنغولية السكرية المختلفة بالمقارنة مع المعايير الصناعية. هذا الأسلوب لديه حساسية لقياس 1٪ iGb3 بين ايزومرات Gb3، عند 2 fmol من خليط iGb3/Gb3 موجود مجموع 9.
ويمكن استخدام مطياف الكتلة ايون فخ لتحليل ايزومرات. على سبيل المثال، لتحليل وجود globotriaosylceramide وisoglobtriaosylceramide في نفس العينة، يمكن للمرء استخدام تفتيت جزيئات glycosphingolipid هيكليا للتمييز بين الاثنين (انظر أدناه الشكل 5). وعلاوة على ذلك، الكيميائية تعديل الأنصاف السكر (من خلال رد فعل permethylation) يحسن من الكفاءة وتجزئة التأين للحساسية ونوعية أعلى، ويزيد من استقرار بقايا الحامض اللعابي. لا يمكن أن يؤديها التعديل الكيميائي للاستخراج والشحميات السفنغولية السكرية في غطاء محرك السيارة الكلاسيكية الكيميائية المعتمدة، ويمكن القيام بها في مطياف الكتلة الأساسية من قبلمرافق للصكوك أيون MS الفخ.
وglycome، وهو مصطلح ابتدعه تشبيها له الجينوم وبروتيوم، ويشير إلى جميع الهياكل ساكاريد للكائن الحي. سوف نفهم تماما لمهام متعددة من ارتباط بالغليكوزيل تتطلب اتباع نهج متكامل بما في ذلك الدراسات الفنية والهيكلية غليكوميكس. معقدة على حد سواء وفقا لطبيعة غير مدفوعة قالب من الحيوي غليكان، وتعقد الناجمة عن ذلك وتنوع الهياكل غليكان، وإشراك المتكرر للهيكل الجزء اللاسكري في تحوير التفاعلات يجند مستقبلات غليكان على المستوى الجزيئي، وأهمية وظيفية وفرة من يغاندس منخفضة.
ومن المسلم به عموما أن قياس الطيف الكتلي (MS) هو وسيلة لا غنى عنها للدراسات غليكوميكس الهيكلية، وخاصة بالنسبة للتحديد وتوصيف يغاندس فرة منخفضة. لمراقبة glycans أو غليكوكونجوغاتيس عن الأنواع الجزيئية، ونحن غالبا ما تستخدم كفاءة عالية، انخفاض الطاقة التأين الأسلوب، ودعا التأين electrospray (ESI). لمزيد من ديت ailed توصيف هيكل غليكان، من الضروري لتحديد الأنواع الجزيئية الفردية وكسر glycans إلى أجزاء أصغر. ويتم ذلك عادة عن طريق الاصطدام الناجم عن التفكك، الذي ينطوي على تفعيل glycans من خلال اصطدام مع جزيئات غاز خامل. وزيادة الطاقة يدفع الكسر السندات، والتحليل المنهجي لالشظايا الناجمة يوفر معلومات حول التركيب الجزيئي للغليكان. في كثير من الأحيان، يمكن إنشاء "التوقيع" شظايا ويمكن تشخيصها عن السمات الخاصة الهيكلية غليكان. جنبا إلى جنب مع الكتلة الجزيئية، يمكن لهذه الشظايا تكون أحيانا كافية لتحديد glycans، ولكن في الماضي كان يتطلب المزيد من المعلومات لوصف الكامل لهم، خاصة إذا كان الهيكل هو الرواية. هذه الطرق تشمل تحليل السكر تكوين والغاز مطياف الكتلة اللوني تحليل الأسيتات alditol ميثليته جزئيا للتحليل الربط، ومحددة الهضم غليكوزيداز 17.
<p class="jove_content"> كما تبين خلال العقد الماضي 18-19، جولات متعددة من تجزئة منخفضة الطاقة، والتي يمكن تنفيذها بفعالية في مطياف الكتلة ايون فخ (IT-MS)، ويحسن إلى حد كبير من المعلومات من تحليل العائد الشامل غليكان الطيفية . مع أربعة أو خمس جولات من تجزئة (والذي لا يمكن القيام به مع الصكوك MS أخرى)، فمن الممكن أن نميز glycans ايزوميريا التي تحتوي على مكونات السكر نفس مرتبة في الروابط السكر مختلفة، حتى عندما كانت هذه موجودة معا في خليط من المكونات مع نفس الكتلة الجزيئية (أيسوبار). لهذا التحليل، فإن glycans derivatized، لتحل محل جميع الفئات الهيدروكسيل الحرة مع مجموعات الميثيل باستخدام permethylation. بينما الاحالة الهيكلية للglycans هو ممكن دون permethylation، ويزيد من حساسية permethylation 17.وتضافرت Levery تشو، كل من المزايا المحتملة للIT-MS منهجية، بما في ذلك الكشف عن stru ايزوميرياctures باستخدام أيونات التوقيع التشخيص، يمكن ملاحظتها فقط في 4 و MS MS الأطياف 5، لتحديد الكميات وحساسة للغاية من الشحميات السفنغولية السكرية الموجودة في شكل مخاليط متعددة إسوي الضغط 7-9. من الناحية النظرية، ونحن قد تكون قادرة على تحديد هيكل كل شحمي سكري القائمة، في انتظار توفر السكرية القياسية، والتي يمكن تصنيعه كيميائيا.
الخطوات الحاسمة لهذا التحليل هي معدل الاسترداد من GSLs من العينات البيولوجية. يمكن استرداد عادة 80 ميكروغرام من GSL من 100 مليون الخلايا السرطانية مثل RBL. لتوليد الأيونات الجزيئية كافية لجولات متعددة من تجزئة في الطيف الشامل ايون فخ، يطلب من لا يقل عن 10 ميكروجرام من GSLs الورم. سوف العائد المنخفض من خلال تنقية GSLs يؤدي إلى وفرة من الأيونات المنخفضة، التي لا يمكن أن تخضع لمزيد من التشرذم. نجاح التحليل يتوقف على مقدار GSLs التي يتم استردادها. اضرب عادة النهائي،يجب entration من GSLs permethylated يصل إلى 1 ملغ / مل، يذوب في الميثانول، قبل أن يتم تحليلها على مصدر نانو electrospray. الحد الأقصى لتحليل دقيق ن MS يعتمد على وفرة من أيون محددة في الملف الشخصي 1 MS. مطلوب نموذجية فرة ه أيون 7 لتحليل دقيق 5 مللي. يمكن أن يكون سبب انخفاض العائد من خلال تنقية GSLs من فقدان GSLs أثناء الخطوة peracetylation (الذي يزيل الدهون الفوسفاتية)، عندما يجب أن تكون ملزمة للGSLs لكل الأسيتيل إلى الراتنج Florisil العمود اللوني، وغسلها، ومزال في وقت لاحق. لضمان الربط لكل من الأسيتيل GSLs إلى هلام السيليكا، ينبغي إعادة تحميل عينات مرتين إلى العمود اللوني بعد تتدفق من خلال.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم DZ من مركز اندرسون للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة منح AI079232. ويدعم مركز إم دي أندرسون للسرطان في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |