면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 – 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.
Glycosphingolipids (GSL의)는 이러한 배아 개발, 신호 전달, 그리고 면역 수용체 인식 1-2로 크게 생물학적 과정에 대한 구조적 정보를 부담 biomacromolecules의 glycoconjugate 클래스에 속한다. 그들은 복잡한 isomers의 형태로 설탕 moieties 및 지방산 아실 체인 길이, unsaturation, 그리고 hydroxylation 등의 형태 지질 moieties가 포함되어 있습니다. 탄수화물과 ceramide 부분은 모두 생물학적 중요성을 기준으로 할 수 있습니다. 예를 들어, 트라이 – hexosylceramides는 globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer)과 동일한 분자 질량 만 3-4 완전히 다른 생물학적 기능에 대한 책임 탄수화물 잔기의 고유 한 설탕 연계가 isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)를 포함합니다. 또 다른 예에서, 그것은 입증 된 알파 – galactosylceramide, invari에 대한 강력한 작용제의 리간드의 ceramide 부분의 수정개미 NKT 세포, 암 및 면역 질환 5 동물 모델의 변화의 시토 킨 분비 프로필 및 기능을. 면역 기관의 isomers와 세포의 구조 분석을 수행의 어려움은 많은 생물학적 기능주세요 6을 결정하기위한 장벽 역할을합니다.
여기, 우리는 7-9 면역 세포의 glycosphingolipid 프로파일을 상대적으로 간단하고 빠른, 그리고 민감한 분석 방법의 시각화 버전을 제시한다. 이 방법은 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화하여 이후의 분석에 이어 glycosphingolipids 10-15의 추출 및 화학적 수정 (permethylation가 그림 5A 아래 참조 hexose의 OH 그룹이 permethylation 반응 후 MeO로 대체 된) 시간을 기준으로 의 기내 질량 분광법 (MALDI-TOF/MS)와 이온 트랩 질량 분광법. 이 방법은 완전한 분석을위한 50,000,000 면역 세포가 필요합니다. 실험은 일주일 이내에 완료 할 수 있습니다. 다양한 glycosphingolipids의 상대 풍부은 합성 표준 비교로 구분 할 수 있습니다. 총 iGb3/Gb3 혼합물의 두 fmol 9 존재할 때이 방법은, Gb3 isomers 중 1퍼센트에게 iGb3을 측정 감도를 갖추고 있습니다.
이온 트랩 질량 분광법은 isomers를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 동일한 샘플에서 globotriaosylceramide과 isoglobtriaosylceramide의 존재를 분석하고, 하나는 구조적으로 두 (그림 5 아래 참조) 사이에 차별을 glycosphingolipid 분자의 조각을 사용할 수 있습니다. 또한, 설탕 moieties의 화학 수정은 (permethylation 반응을 통해) 높은 감도 및 특이성에 대한 이온화 및 조각화 효율성을 향상하고, sialic 산성 잔류의 안정성을 증가시킵니다. glycosphingolipids의 추출 및 화학적 수정은 고전 인증 화학 후드에서 수행 할 수 있으며, 질량 분광법은 코어에 의해 수행 될 수이온 트랩 MS 장비와 시설을 갖추고 있습니다.
glycome, 게놈과 프로테옴에 비유 년에 주장 용어 유기체의 모든 saccharide 구조를 의미합니다. 완전히 글리코 실화의 매니 폴드 기능을 이해하기 위해서는 두 기능 및 구조 glycomics 연구 등의 통합 된 접근 방식을 필요합니다. 모두 glycan 생합성, glycan 구조의 결과 복잡성과 다양성, 분자 수준의 변조 glycan 리간드 – 수용체 상호 작용의 aglycone 구조의 자주 참여, 낮은 풍부한의 리간드의 기능 중요성의 비 템플릿 기반의 자연 복잡합니다.
그것은 일반적으로 대량 분석법 (MS)가 특히 낮은 풍부한의 리간드를 파악하고 특성화를위한 구조 glycomics 연구를위한 필수적인 방법입니다 가능합니다. 분자 종으로 glycans 또는 glycoconjugates을 관찰하기 위해, 우리는 종종 전기 분무 이온화 (ESI)라는 고효율, 낮은 에너지 이온화 방법을 사용합니다. 더 나온에 대한glycan 구조의 특성 ailed, 그것은 각각의 분자 종을 선택한 후 작은 조각으로 glycans을 깨는 것이 중요합니다. 이것은 일반적으로 불활성 가스 분자와 충돌을 통해 glycans를 활성화 관련 충돌 유발 분해에 의해 이루어집니다. 증가 에너지는 본드 파손을 유도하고, 결과 조각의 체계적 분석은 glycan의 분자 구조에 대한 정보를 제공합니다. 종종, "서명"조각은 특정 glycan 구조 기능에 대한 진단 아르 그 생성 할 수 있습니다. 함께 분자 질량이 조각은 구조가 소설, 특히 때때로 glycans를 식별하기 위해 충분한 수 있지만 과거에 더 많은 정보가 완전히를 특징하는 데 필요한되었습니다. 이러한 방법은 설탕 성분 분석, 연계 분석을위한 부분적으로 methylated alditol acetates의 가스 크로마토 그래피 질량 분광법 분석, 특정 glycosidase의 소화 17 등이 있습니다.
<p class="jove_content는">으로 지난 십 년 18-19 동안 시연, 효과적으로 (IT-MS) 이온 트랩 질량 분석기에서 수행 할 수 있습니다 낮은 에너지 조각, 여러 발은 크게 glycan 질량 스펙트럼 분석의 정보 수율을 향상 . 단편화 (다른 MS 악기 짓을 할 수없는)의 4 5 판으로, 이러한이 같은과 구성 요소의 혼합물에 함께 존재하는 경우에도, 다른 설탕 연계에 배치 같은 설탕 구성 요소가 포함 이성질체 glycans를 구별 할 수 있습니다 분자 질량 (isobars). 이 분석은 glycans는 permethylation를 사용하여 메틸 그룹과 무료로 히드 록실 그룹을 대체 derivatized했다. glycans의 구조 임무가 permethylation없이 가능하지만, permethylation이 감도 17 증가한다.Levery과 저우는 이성질체 stru의 검출 등의 IT-MS 방법론의 잠재적 인 장점을 모두를 결합했습니다여러 isobaric 혼합물 7-9의 형태로 존재 glycosphingolipids의 고감도 식별 및 quantitation에 대한 MS 4 MS 5 스펙트럼에서만 관찰 서명 진단 이온을 사용 ctures. 이론적으로, 우리는 화학적으로 합성 할 수 있습니다 표준 glycolipids의 가용성중인 모든 기존 glycolipid 구조를 식별 할 수 있습니다.
이 분석의 중요한 단계는 생물학적 샘플에서 GSLs의 회복 속도입니다. GSL의 일반적으로 80 μg이 같은 RBL 등 100,000,000 종양 세포에서 복구 할 수 있습니다. 이온 트랩 질량 분석기의 조각의 여러 라운드에 대한 충분한 분자 이온을 생성하려면, 종양 GSLs의 최소 10 마이크로 그램이 필요합니다. 정화 중 GSLs의 낮은 수율은 또한 조각의 대상이 될 수 없습니다 이온의 낮은 풍부한 될 것입니다. 분석의 성공은 복구 아르 GSLs의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로, 최종의 concpermethylated GSLs의 entration는 나노 전기 분무 소스에 분석되기 전에, 메탄올에 용해 한 MG / ML에 도달해야합니다. 철저한 MS N 분석을위한 제한은 MS 하나의 프로필에서 특정 이온의 풍부한에 따라 달라집니다. 일반적인 전자 7 이온 풍부은 철저한 MS 오 분석이 필요합니다. 정화 중 GSLs의 낮은 수율은 당 acetylated GSLs가 Florisil 수지 크로마토 그래피 컬럼에 바인딩 세척하고, 이후 용출해야합니다 peracetylation 단계에서 GSLs의 손실 (phospholipids를 제거하는)에 의해 발생할 수 있습니다. 실리카 겔에 당 acetylated GSLs의 바인딩을 보장하기 위해 샘플이 흐르는 후 크로마토 그래피 칼럼에 두 번 다시로드해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
DZ는 MD 앤더슨 암 센터와 NIH 보조금 AI079232에서 지원됩니다. MD 앤더슨 암 센터는 NIH 보조금 CA16672에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |