Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.
Glicoesfingolípidos (GSL) pertenecen a la clase glicoconjugado de biomacromoléculas, que llevan información estructural de importantes procesos biológicos tales como el desarrollo embrionario, la transducción de señales, y el reconocimiento del receptor inmune 1-2. Ellos contienen restos de azúcar complejas en forma de isómeros, y restos lipídicos con variaciones que incluyen la longitud de cadena de acilo graso, insaturación, y la hidroxilación. Ambas porciones de hidratos de carbono y la ceramida puede ser base de importancia biológica. Por ejemplo, tri-hexosylceramides incluyen globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) y isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que tienen masas moleculares idénticas pero diferentes vínculos de azúcar del resto carbohidrato, responsable de las funciones biológicas completamente diferentes 3-4. En otro ejemplo, se ha demostrado que la modificación de la parte de ceramida de la alfa-galactosilceramida, un ligando agonista potente para invariablementehormigas células NKT, cambios de sus perfiles de secreción de citoquinas y la función en modelos animales de cáncer y enfermedades autoinmunes-5. La dificultad en la realización de un análisis estructural de isómeros en los órganos inmunes y células sirven como una barrera para la determinación de muchas funciones biológicas 6.
Aquí, se presenta una versión visualizada de un método para el análisis relativamente simple, rápido y sensible de los perfiles de glucoesfingolípidos en las células inmunes 7-9. Este método se basa en la modificación de extracción y química (permetilación, ver más abajo la Figura 5A, todos los grupos OH de hexosa fueron reemplazados por MeO después de la reacción permetilación) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido por análisis posterior mediante láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS) y espectrometría de masas de trampa de iones. Este método requiere de 50 millones de células inmunes para un análisis completo. Los experimentos se puede completar en una semana. La abundancia relativa de los glicoesfingolípidos diferentes pueden ser delineadas por comparación con estándares sintéticos. Este método tiene una sensibilidad de medición de 1% iGb3 entre Gb3 isómeros, cuando 2 fmol del total iGb3/Gb3 mezcla está presente 9.
Trampa de iones de espectrometría de masas puede utilizarse para analizar los isómeros. Por ejemplo, para analizar la presencia de globotriaosilceramida y isoglobtriaosylceramide en la misma muestra, se puede utilizar la fragmentación de moléculas estructuralmente glucoesfingolípidos para discriminar entre los dos (véase más adelante la figura 5). Además, la modificación química de los restos de azúcar (a través de una reacción permetilación) mejora la eficiencia de ionización y fragmentación para una mayor sensibilidad y especificidad, y aumenta la estabilidad de los residuos de ácido siálico. La modificación química de extracción y glicoesfingolípidos se puede realizar en una campana química clásica certificado, y la espectrometría de masas puede ser realizada por núcleoinstalaciones con instrumentos de trampa de iones MS.
El glicoma, un término acuñado en analogía con el genoma y el proteoma, se refiere a todas las estructuras de sacárido de un organismo. Para comprender plenamente las múltiples funciones de la glicosilación requerirá un enfoque integrado que incluye tanto estudios glicómica funcionales y estructurales. Ambos se complica por la naturaleza no accionado plantilla de la biosíntesis de glicanos, la complejidad resultante y la diversidad de las estructuras de glicano, la frecuente participación de estructura de aglicona en la modulación de glicano ligando-receptor interacciones a nivel molecular, y la importancia funcional de los ligandos de baja abundancia.
En general se acepta que la espectrometría de masas (MS) es un método indispensable para estudios glicómica estructurales, especialmente para identificar y caracterizar ligandos de baja abundancia. Para observar glicanos o glicoconjugados como especies moleculares, a menudo utilizar una alta eficiencia, baja energía de ionización método, llamado ionización electrospray (ESI). Para más detailed caracterización de la estructura de glicano, es esencial para seleccionar especies moleculares individuales y romper los glicanos en pedazos más pequeños. Esto se hace normalmente por disociación inducida por colisión, que implica la activación de los glicanos a través de colisión con moléculas de gas inerte. El aumento de la energía induce rotura del enlace, y el análisis sistemático de los fragmentos resultantes proporciona información acerca de la estructura molecular de la glicano. A menudo, "firma" pueden generarse fragmentos que son diagnósticos de determinadas características estructurales glicano. Junto con la masa molecular, estos fragmentos a veces puede ser suficiente para la identificación de glicanos, pero en el pasado mucha más información ha sido requerido para caracterizar plenamente ellos, particularmente si la estructura es novedosa. Estos métodos incluyen el análisis de azúcar en la composición, la masa de cromatografía de gases espectrometría de análisis parcialmente metilados acetatos alditol para análisis de ligamiento, digestión y glicosidasa específico 17.
<p class="Jove_content"> Como se ha demostrado en la última década 18-19, múltiples rondas de fragmentación de baja energía, que puede llevarse a cabo eficazmente en un espectrómetro de masas de trampa de iones (IT-MS), mejora en gran medida el rendimiento de la información a partir del análisis espectral de masas glicano . Con cuatro o cinco rondas de fragmentación (que no se puede hacer con otros instrumentos MS), es posible distinguir glicanos isoméricas que contienen los componentes de azúcar mismos dispuestos en enlaces de azúcar diferentes, incluso cuando estos están presentes juntos en mezclas de componentes con la misma masa molecular (isobaras). Para este análisis, los glicanos se derivaron, en sustitución de los grupos hidroxilo libres con grupos metílicos, utilizando permetilación. Mientras asignación estructural de los glucanos es posible sin permetilación, la permetilación aumenta la sensibilidad 17.Levery y Zhou, se han combinado todas las ventajas potenciales de la TI-MS metodología, incluyendo la detección de isómeros estructures utilizando iones de firma de diagnóstico, sólo observables en MS 4 y 5, espectros de MS para la identificación y cuantificación altamente sensible de glicoesfingolípidos presentes en forma de múltiples mezclas isobáricas 7-9. En teoría, se puede ser capaz de identificar cada estructura glicolípido existente, a la espera de la disponibilidad de los glicolípidos estándar, que pueden ser sintetizados químicamente.
Los pasos críticos de este análisis son la tasa de recuperación de los GSL de muestras biológicas. Típicamente 80 g de GSL se puede recuperar de 100 millones de células tumorales tales como RBL. Para generar suficientes iones moleculares de múltiples rondas de fragmentación en espectrómetros de masas de trampa de iones, al menos 10 microgramos de GSL tumorales se requieren. Bajo rendimiento de GSL durante la purificación dará lugar a la baja abundancia de iones, los cuales no podían ser sometidos a una mayor fragmentación. El éxito de análisis es dependiente de la cantidad de GSL que se recuperan. Típicamente, concentración finalentration de GSL permetilados debe llegar a 1 mg / ml, se disolvió en metanol, antes de ser analizados en una fuente de nano-electrospray. El límite para un análisis minucioso MS n es dependiente de la abundancia de ión específico en el perfil de MS 1. Un típico e 7 abundancia de iones es necesario para una completa MS análisis 5. El bajo rendimiento de los GSL durante la purificación puede ser causada por la pérdida de los GSL durante el paso peracetilación (que elimina los fosfolípidos), cuando los GSL por-acetilados debe estar enlazado a cromatografía en columna de Florisil resina, se lavó, y se eluyó posteriormente. Para asegurar la unión de por-acetilados GSL a gel de sílice, las muestras deben ser recargadas dos veces a la columna de cromatografía después de fluir a través de.
The authors have nothing to disclose.
DZ es apoyado por el MD Anderson Cancer Center y el NIH AI079232 subvenciones. MD Anderson Cancer Center es apoyado en parte por el NIH subvención CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |