Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.
Glicoesfingolípidos (GSL) pertencem à classe de glicoconjugado biomacromoléculas, que levam informações estruturais significativas para os processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, a transdução de sinal, e no reconhecimento imunológico do receptor 1-2. Eles contêm porções de açúcar complexos, sob a forma de isómeros, e porções lipídicas, com variações, incluindo comprimento de cadeia acilo gordo, de insaturação, e hidroxilação. Ambas as porções de hidrato de carbono e de ceramida pode ser base de significância biológica. Por exemplo, o tri-hexosylceramides incluem globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que possuem massas moleculares idênticas mas ligações de açúcar diferentes de fracção de hidratos de carbono, completamente responsável por diferentes funções biológicas 3-4. Em outro exemplo, demonstrou-se que a modificação da parte ceramida de alfa-galactosilceramida, um ligando agonista potente para invariantecélulas NK, mudanças de formigas seus perfis de citocinas secreção e função em modelos animais de câncer e doenças auto-imunes 5. A dificuldade na realização de uma análise estrutural de isómeros nos órgãos e células imunes servir como uma barreira para a determinação muitas funções biológicas 6.
A seguir, apresentamos uma versão visualizada de um método de análise relativamente simples, rápido, sensível e de perfis de glicoesfingolipídeos em células imunes 7-9. Este método baseia-se na extracção e modificação química (permetilação, ver abaixo Figura 5A, todos os grupos OH de hexose foram substituídos por MeO após reacção permetilação) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido de posterior análise usando laser assistida por matriz de dessorção / ionização-tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS) e espectrometria de massa de íons armadilha. Este método exige 50 milhões de células imunes para uma análise completa. Os experimentos podem ser concluídas dentro de uma semana. A abundância relativa dos vários glicoesfingolípidos pode ser delineada por comparação com padrões sintéticos. Este método tem uma sensibilidade de medição de 1% entre iGb3 Gb3 isómeros, quando da mistura de 2 fmol iGb3/Gb3 total está presente 9.
Espectrometria de massa de iões de captura podem ser utilizadas para analisar os isómeros. Por exemplo, para analisar a presença de globotriaosilceramida isoglobtriaosylceramide e na mesma amostra, pode-se utilizar a fragmentação de moléculas estruturalmente glicoesfingolipídeos a discriminar entre os dois (ver Figura 5 abaixo). Além disso, a modificação química das porções açúcar (por meio de uma reacção de permetilação) melhora a eficiência de ionização e fragmentação de maior sensibilidade e especificidade, e aumenta a estabilidade dos resíduos de ácido siálico. A modificação química de extracção e glicoesfingolípidos pode ser realizada em um capuz clássico químicas certificadas, e a espectrometria de massa pode ser realizada por núcleoinstalações com instrumentos ion trap MS.
O glycome, cunhado em analogia com o genoma e proteoma, refere-se a todas as estruturas de sacarídeos de um organismo. Para compreender plenamente as funções múltiplas de glicosilação exigirá uma abordagem integrada, incluindo ambos os estudos funcionais e estruturais Glicômica. Ambos são complicados pela natureza não-molde dirigido de glicano biossíntese, a complexidade resultante e diversidade de estruturas de glicano, o frequente envolvimento de estrutura aglicona na modulação de glicano interacções ligando-receptor ao nível molecular, bem como a importância funcional de ligandos de baixa abundância.
É geralmente aceite que a espectrometria de massa (MS) é um método indispensável para estudos estruturais Glicômica, especialmente para identificação e caracterização de ligandos de baixa abundância. Para observar glicanos ou glicoconjugados como espécies moleculares, muitas vezes usamos um altamente eficiente, o método de ionização baixa energia, chamado de ionização electrospray (ESI). Para mais detailed caracterização da estrutura de glicano, é essencial para seleccionar espécies moleculares individuais e quebrar os glicanos em pedaços menores. Isto é normalmente feito por dissociação induzida por colisão, o que envolve a activação dos glicanos por colisão com as moléculas de gás inerte. O aumento da energia induz quebras ligação, e uma análise sistemática dos fragmentos resultantes fornece informações sobre a estrutura molecular do glicano. Muitas vezes, "assinatura" de fragmentos pode ser gerada, que é diagnóstico para determinadas características estruturais de glicano. Em conjunto com a massa molecular, estes fragmentos podem, por vezes, ser suficiente para a identificação de glicanos, mas no passado muito mais informação tiver sido solicitada para caracterizar completamente a eles, em particular, se a estrutura é nova. Estes métodos incluem a análise de açúcar a composição, a análise de cromatografia gasosa espectrometria de massa de parcialmente metilados alditol acetatos para a análise de ligação e digestão glicosidase específico 17.
<p class="Jove_content"> Como demonstrado na última década 18-19, múltiplos ciclos de fragmentação de baixa energia, o qual pode ser eficazmente levada a cabo num espectrómetro de massa de armadilha de iões-(IT-MS), melhora significativamente o rendimento de informações a partir de glicano análise espectral de massa . Com quatro ou cinco ciclos de fragmentação (que não pode ser feito com outros instrumentos de MS), é possível distinguir glicanos isoméricas que contêm os componentes de açúcar mesmas dispostas em ligações de açúcar diferentes, mesmo quando estes estão presentes em conjunto em misturas de componentes com a mesma massa molecular (isóbaras). Para esta análise, os glicanos foram derivatizadas, substituindo todos os grupos hidroxilo livres com grupos metilo utilizando permetilação. Enquanto atribuição estrutural dos glicanos é possível sem permetilação, a permetilação aumenta a sensibilidade 17.Levery e Zhou, têm combinado de todas as vantagens potenciais da TI-MS metodologia, incluindo a detecção de isomérica structures utilizando iões de assinatura de diagnóstico, apenas observáveis em MS 4 e 5, os espectros de MS para a identificação de elevada sensibilidade e quantificação de glicoesfingolípidos presentes sob a forma de misturas de várias isobáricas 7-9. Em teoria, pode ser capaz de identificar cada estrutura glicolipídeo existente, enquanto se aguarda a disponibilidade de glicolipídeos padrão, que podem ser sintetizados quimicamente.
Os passos críticos dessa análise são a taxa de recuperação de GSLs de amostras biológicas. Tipicamente 80 ug de GSL podem ser recuperados a partir de 100 milhões de células de tumor, tais como RBL. Para gerar suficientes iões moleculares para múltiplos ciclos de fragmentação em espectrómetros ion-trap de massa, pelo menos 10 microgramas de GSLs tumorais são necessários. Baixo rendimento durante a purificação de GSLs conduzirá a baixa abundância de iões, que não podiam ser submetidos a nova fragmentação. O sucesso da análise é dependente da quantidade de GSL que são recuperados. Tipicamente, concentração finalentration de GSLs permetilada deve chegar a 1 mg / ml, dissolvida em metanol, antes de ser analisado numa fonte de nano-electrospray. O limite de uma análise minuciosa MS n depende da abundância de iões específico em MS perfil 1. Um típico e abundância de iões 7 é necessário para uma completa análise MS 5. O baixo rendimento de GSLs durante a purificação pode ser causada por uma perda de GSLs durante o passo peracetylation (que remove os fosfolípidos), quando os GSLs per-acetilados devem ser ligados a resina de cromatograf ia de coluna de Florisil, lavou-se, e subsequentemente eluída. A fim de assegurar a ligação de per-acetilados GSLs para gel de sílica, as amostras devem ser recarregado duas vezes para a coluna de cromatograf ia depois flui através.
The authors have nothing to disclose.
DZ é suportado pelo MD Anderson Cancer Center e bolsas NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelo NIH concessão CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |