En specifik og følsom metode til at få indsigt i udtrykket profil glycosphingolipid antigener i immune organer og celler er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af den ion-trap massespektrometri tillader trinvis fragmentering af glycosphingolipid molekyler til strukturel analyse i sammenligning med kemisk syntetiserede standarder.
Glycosphingolipider (GSL s) tilhører det glycokonjugatet klasse af biomakromolekyler, der bærer strukturel information for signifikante biologiske processer såsom embryonisk udvikling, signaltransduktion, og immun receptorgenkendelse 1-2. De indeholder komplekse sukkergrupper i form af isomerer, og lipiddele med variationer herunder fedtacyl kædelængde, umættethed og hydroxylering. Både carbohydrat og ceramid dele kan være grundlag for biologisk betydning. For eksempel indbefatter tri-hexosylceramides globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har identiske molekylmasser men distinkte sukkerbindinger af kulhydratdelen, der er ansvarlig for fuldstændig forskellige biologiske funktioner 3-4. I et andet eksempel er det blevet vist, at modifikation af ceramid del af a-galactosylceramid, er en potent agonist ligand for invariant NKT-celler, ændringer deres cytokinsekretion profiler og funktion i dyremodeller for cancer og autoimmune sygdomme 5. Vanskeligheden ved at udføre en strukturel analyse af isomerer i immune organer og celler tjener som en barriere til bestemmelse af mange biologiske funktioner 6.
Her præsenteres en visualiseret version af en fremgangsmåde til relativt enkel, hurtig og følsom analyse af glycosphingolipid profiler i immunceller 7-9. Denne metode er baseret på ekstraktion og kemisk modifikation (permethylering, se nedenfor figur 5A, blev alle OH-grupper hexose erstattet af MeO efter permethylering reaktion) af glycosphingolipider 10-15, efterfulgt af efterfølgende analyse under anvendelse af matrix-assisteret laser desorption / ionisering time- of-flight massespektrometri (MALDI-TOF/MS) og ion-trap massespektrometri. Denne metode kræver 50000000 immunceller for en fuldstændig analyse. Forsøgene kan gennemføres inden for en uge. Den relative forekomst af de forskellige glycosphingolipider kan være afgrænset ved sammenligning med syntetiske standarder. Denne metode har en følsomhed til at måle 1% iGb3 blandt Gb3 isomerer, hvor 2 fmol af total iGb3/Gb3 blanding er til stede 9.
Ion trap massespektrometri, kan anvendes til at analysere isomerer. For eksempel, for at analysere tilstedeværelsen af globotriaosylceramid og isoglobtriaosylceramide i den samme prøve kan man anvende fragmenteringen af glycosphingolipid molekyler til strukturelt skelne mellem de to (jf. nedenfor figur 5). Desuden kemisk modifikation af sukkergrupper (gennem en permethylering reaktion) forbedrer ionisering og fragmentering effektivitetsgevinster for højere følsomhed og specificitet, og øger stabiliteten af sialinsyrerester. Udvinding og kemisk modifikation af glycosphingolipider kan udføres i en klassisk certificeret kemisk hætte, og massespektrometri kan udføres ved corefaciliteter med ionfælde MS instrumenter.
The glycome, et begreb opfundet analogt med genomet og proteomet, henviser til alle saccharidstrukturer i en organisme. For fuldt ud at forstå de mangfoldige funktioner glycosylering vil kræve en integreret tilgang, der omfatter både funktionelle og strukturelle glycomics undersøgelser. Begge er kompliceret af ikke-template drevne karakter glycan-biosyntese, den resulterende komplekse og forskelligartede glycan strukturer, den hyppige inddragelse af aglycon struktur i modulering glycan ligand-receptor-vekselvirkninger på molekylært niveau, og den funktionelle betydning af lav hyppighed ligander.
Det er almindeligt accepteret, at massespektrometri (MS) er en uundværlig metode for strukturelle glycomics undersøgelser, især for at identificere og karakterisere lav hyppighed ligander. At observere glycans eller glycokonjugater som molekylarter, bruger vi ofte en meget effektiv, lavt energiforbrug ioniseringsmetode, kaldet elektrospray (ESI). For mere itfejlede karakterisering af glycan struktur, er det vigtigt at vælge enkelte molekylarter og bryde glycaner i mindre stykker. Dette gøres normalt ved kollision-induceret dissociation, som involverer aktivering af glycans gennem kollision med inert gas molekyler. Den øgede energi inducerer obligation brud, og systematisk analyse af de resulterende fragmenter indeholder oplysninger om den molekylære struktur af glycan. Ofte kan "signatur"-fragmenter genereres der er diagnostiske for særlige glycan strukturelle træk. Sammen med den molekylære masse, kan disse fragmenter undertiden være tilstrækkelig til at identificere glycans, men tidligere meget mere information er nødvendig for fuldt ud at karakterisere dem, især hvis strukturen er hidtil ukendt. Disse fremgangsmåder indbefatter sukker præparat analyse, gaskromatografi-massespektrometri-analyse af delvist methylerede alditolacetater til bindingsanalyse, og specifikke glykosidase fordøjelse 17.
<p class="Jove_content"> Som påvist i det seneste årti 18-19, flere runder af lavenergi fragmentering, der effektivt kan gennemføres i et ion-trap-massespektrometer (IT-MS), i høj grad forbedrer information udbytte af glycan massespektralanalyse . Med fire eller fem runder af fragmentering (som ikke kan gøres med andre MS instrumenter), er det muligt at skelne isomere glycaner, der indeholder de samme sukkerkomponenter arrangeret i forskellige sukkerbindinger, selv om de er til stede sammen i blandinger af komponenter med samme molekylmasse (isobarer). I denne analyse var glycans derivatiseret, erstatte alle frie hydroxylgrupper med methylgrupper hjælp permethylering. Mens strukturel overdragelse af glycaner er mulig uden permethylering, at permethylering øger følsomheden 17.Levery og Zhou, har kombineret alle de potentielle fordele ved IT-MS metode, herunder afsløring af isomere structures hjælp signatur diagnostiske ioner, iagttages kun i MS 4 og MS 5 spektre, for meget følsom identifikation og kvantificering af glycosphingolipider stede i form af flere isobar blandinger 7-9. I teorien kan vi være i stand til at identificere alle eksisterende glycolipid struktur, indtil der foreligger standardiserede glycolipider, som kan være kemisk syntetiserede.
De kritiske trin i denne analyse er genfindingsprocenten for GSL'er fra biologiske prøver. Typisk 80 ug af GSL kan udvindes fra 100 millioner tumorceller såsom RBL. At frembringe tilstrækkelige molekylioner for multiple runder af fragmentering i ion-trap-massespektrometre er mindst 10 mikrogram tumor GSL'er påkrævet. Lavt udbytte af GSL'er under oprensning vil føre til lav overflod af ioner, som ikke kunne foretages en yderligere opsplitning. Succesen af analysen afhænger af mængden af GSL'er, som udvindes. Typisk slutkoncentrationentration af permethylerede GSL'er skal være 1 mg / ml, opløst i methanol, før de analyseres på en nano-elektrospray kilde. Grænsen for en grundig MS n analyse er afhængig af den overflod af specifik ion i MS 1 profil. En typisk e 7 ion overflod er nødvendige for en grundig MS 5 analyse. Det lave udbytte af GSL'er under oprensning kan skyldes tab af GSL'er under peracetylering trin (som fjerner phospholipiderne), når de per-acetylerede GSL'er skal være bundet til Florisil resin chromatografisøjle, vasket, og derefter elueret. At sikre bindingen af per-acetylerede GSL'er til silicagel, skal prøver genindlæses to gange til kromatografisøjlen efter at være strømmet igennem.
The authors have nothing to disclose.
DZ understøttes af MD Anderson Cancer Center og NIH tilskud AI079232. MD Anderson Cancer Center er delvist understøttet af NIH tilskud CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |