En specifik och känslig metod för att få insikt i uttrycket profil glykosfingolipid antigener i immunsystemet organ och celler beskrivs. Metoden drar fördel av jonfälla masspektrometri tillåter stegvis fragmentering av glykosfingolipid molekyler för strukturell analys i jämförelse med kemiskt syntetiserade standarderna.
Glykosfingolipider (GSL s) hör till glykokonjugat klassen biomakromolekyler, som bär strukturell information för betydande biologiska processer såsom embryonal utveckling, signaltransduktion, och immunförsvaret receptorigenkänning 1-2. De innehåller komplexa sockergrupper i form av isomerer, och enheter lipid med variationer inklusive fettacyl kedjelängd, omättnad, och hydroxylering. Både kolhydrat och ceramid delar kan vara grunden för biologisk betydelse. Till exempel tri-hexosylceramides inkluderar globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) och isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har samma molekylmassor men distinkta kopplingar socker av kolhydratdel, ansvarig för helt andra biologiska funktioner 3-4. I ett annat exempel, har det visats att modifiering av ceramid delen av alfa-galaktosylceramid, en potent agonist ligand för invarimyra NKT celler, förändringar deras profiler cytokinutsöndring och funktion i djurmodeller av cancer och autoimmuna sjukdomar 5. Svårigheten att utföra en strukturell analys av isomerer i immun organ och celler tjänar som en barriär för att bestämma många biologiska funktioner 6.
Här presenterar vi en visualiserad version av en metod för att relativt enkelt, snabbt och känslig analys av glykosfingolipid profiler i immunceller 7-9. Denna metod är baserad på extraktion och kemisk modifiering (permetylering, se nedan figur 5A, alla OH-grupper av hexos ersätts av MeO efter permetylering reaktion) av glykosfingolipider 10-15, följt av efterföljande analys med användning av matris-assisterad laserdesorptions / joniserings tid- of-flight masspektrometri (MALDI-TOF/MS) och jonfälla masspektrometri. Denna metod kräver 50 miljoner immunceller för en komplett analys. Försöken kan genomföras inom en vecka. Den relativa förekomsten av de olika glykosfingolipiderna kan avgränsas genom jämförelse med syntetiska standarder. Denna metod har en känslighet för att mäta 1% iGb3 bland Gb3 isomerer, när 2 fmol totalt iGb3/Gb3 blandning är närvarande 9.
Jonfälla masspektrometri kan användas för att analysera isomerer. Till exempel, för att analysera förekomsten av globotriaosylceramid och isoglobtriaosylceramide i samma prov, kan man använda fragmentering av glykosfingolipid molekyler för att strukturellt skilja mellan de två (se nedan figur 5). Dessutom förbättras kemisk modifiering av sockerdelar (genom en permetylering reaktion) jonisering och effektivitet fragmentering för högre känslighet och specificitet, och ökar stabiliteten hos sialinsyrarester. Extraktionen och kemisk modifiering av glykosfingolipider kan utföras i en klassisk certifierad dragskåp, och masspektrometri kan utföras genom kärnananläggningar med jonfälla MS instrument.
Den glycome, en term som myntades i analogi med genomet och proteome, avser alla sackaridstrukturer hos en organism. För att till fullo förstå de många funktionerna i glykosylering kräver en integrerad strategi med både funktionella och strukturella glycomics studier. Båda kompliceras av den icke-mallbaserade natur glykan biosyntes, den resulterande komplexitet och mångfald glykanstrukturer, ofta flera aglykon struktur i modulera glykan ligand-receptor interaktioner på molekylär nivå och den funktionella betydelsen av låg förekomst ligander.
Det är allmänt accepterat att masspektrometri (MS) är en oumbärlig metod för strukturella glycomics studier, särskilt för att identifiera och karakterisera låg förekomst ligander. För att observera glykaner eller glycoconjugates som molekyler, använder vi ofta en mycket effektiv, låg metod energi jonisering, kallad elektrospray (ESI). För mer DETailed karakterisering av glykan struktur är det viktigt att välja enskilda molekyler och bryta glykaner i mindre bitar. Detta sker normalt genom kollision-dissociation, vilket innebär aktivering glykanema genom kollision med inerta gasmolekyler. Den ökade energin inducerar obligationer brott och systematisk analys av de resulterande fragmenten ger information om den molekylära strukturen av glykan. Ofta kan "signatur" fragment genereras som är diagnostiska för särskilda glykan strukturella drag. Tillsammans med den molekylära massan, kan dessa fragment vara ibland tillräckligt för att identifiera glykaner, men i det förflutna mycket mer information har krävs för att fullständigt karakterisera dem, särskilt om strukturen är ny. Dessa metoder omfattar analys socker sammansättning, gaskromatografi masspektrometri analys av delvis metylerade alditol acetater för kopplingsanalys och specifik glykosidas matsmältningen 17.
<p class="Jove_content"> Som visades under det senaste decenniet 18-19, flera omgångar av låg energi fragmentering, som effektivt kan genomföras i en jon-fälla masspektrometer (IT-MS), avsevärt förbättrar informationen avkastningen från glykan masspektralanalys . Med fyra eller fem omgångar av fragmentering (vilket inte kan göras med andra MS instrument), är det möjligt att skilja isomera glykaner som innehåller samma sockerkomponenter anordnade i olika sockerbindningar, även när dessa är närvarande tillsammans i blandningar av komponenter med samma molekylmassa (isobarerna). För denna analys var glykaner derivatiserade, som ersätter alla fria hydroxylgrupper med metylgrupper med permetylering. Även strukturella tilldelning av glykaner är möjlig utan permetylering ökar permetylering känsligheten 17.Levery och Zhou, har kombinerat alla de potentiella fördelarna med IT-MS metoden, inklusive detektering av isomera structures använder signatur diagnostiska joner, observerbara endast i MS 4 och MS 5 spektra, för mycket känsliga identifiering och kvantifiering av glykosfingolipider föreligger i form av flera isobariska blandningar 7-9. I teorin kan vi kan identifiera varje befintlig glykolipid struktur avvaktan på vanliga glykolipider, som kan syntetiseras kemiskt.
De kritiska steg i denna analys är återvinningsgraden av GSLs från biologiska prover. Normalt 80 pg GSL kan återvinnas från 100 miljoner tumörceller som RBL. Att generera tillräckliga molekylära joner för flera omgångar av fragmentering i jon-fälla masspektrometrar är minst 10 mikrogram tumör GSLs krävs. Lågt utbyte av GSLs under rening kommer att leda till låg förekomst av joner, som inte kunde utsättas för ytterligare fragmentering. Framgången för analysen är beroende på mängden GSLs som återvinns. Typiskt, slutlig koncentration av permetylerad GSLs bör nå 1 mg / ml, löst i metanol, innan de analyseras på en nano-elektrospray källa. Gränsen för en grundlig MS-N-analys är beroende av förekomsten av specifika joner i MS 1 profil. En typisk e 7 jon överflöd krävs för en grundlig MS 5 analys. Det låga utbytet av GSLs under rening kan orsakas av förlust av GSLs under peracetylation steg (som avlägsnar fosfolipiderna), när de per-acetylerade GSLs måste vara bunden till Florisil harts kromatografikolonn, tvättades, och därefter eluerades. För att säkerställa bindningen av per-acetylerade GSLs silikagel, bör prover laddas två gånger till kromatografikolonnen efter att ha strömmat igenom.
The authors have nothing to disclose.
DZ stöds av MD Anderson Cancer Center och NIH bidrag AI079232. MD Anderson Cancer Center stöds delvis av NIH bidrag CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |