لا يمكن أن يؤديها عالية مرت من التحقق من صحة المؤشرات الحيوية مرشح متعددة ELISA متتابعة من أجل تقليل تجميد / الذوبان دورات واستخدام عينات البلازما الثمينة. هنا، ونحن لشرح كيفية أداء بالتسلسل ELISAs لمدة ستة مختلف المؤشرات الحيوية البلازما التحقق من صحة<sup> 1-3</sup> من الطعم ضد المضيف المرض (GVHD)<sup> 4</sup> على عينة البلازما نفسه.
اكتشاف استراتيجيات منحازة البروتيوميات لديها القدرة على تحديد أعداد كبيرة من المؤشرات الحيوية التي يمكن أن تحسن رواية الاختبارات التشخيصية والنذير في عملية إعداد سريرية ويمكن أن تساعد التدخلات العلاجية دليل. عندما يتم تحديد أعداد كبيرة من البروتينات مرشح، قد يكون من الصعب التحقق من صحة المؤشرات الحيوية مرشح في الوقت المناسب والفعال من عينات البلازما التي هي الحدث المريض يحركها، من حجم محدود والتي لا يمكن تعويضها، مثل في بداية الحادة الطعم ضد المرض المضيف (GVHD)، من مضاعفات ربما تهدد حياتهم من خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT).
نحن هنا وصف عملية أداء ELISAs المتاحة تجاريا لبروتينات 6 التحقق من صحة GVHD: IL-2Rα 5، TNFR1 6، HGF 7، IL-8 8، elafin 2، وREG3α 3 (المعروف أيضا باسم PAP1) بطريقة متسلسلة للحد من تجميد ذوبان الجليد دورات، وإذابة الوقت البلازما واستخدام البلازما. لهذا الإجراء ونحن أداء ELISAs في ترتيب تسلسلي على النحو الذي يحدده عامل تخفيف العينة على النحو المحدد في مختبرنا باستخدام مجموعات ELISA الصانع والبروتوكولات مع تعديلات طفيفة لتسهيل الأداء الأمثل ELISA متسلسلة. ويمكن بعد ذلك العلامات البيولوجية الناتجة تركيزات البلازما يتم تجميعها وتحليلها لنتائج هامة ضمن الفوج المريض. ولئن كانت هذه المؤشرات الحيوية حاليا لأغراض البحث فقط، ويعمل حاليا إدماجها في الرعاية السريرية يجري التحقيق في التجارب السريرية.
ويمكن تطبيق هذه التقنية على أداء ELISAs لبروتينات متعددة / السيتوكينات الفائدة على نفس العينة (ق) قدمت عينات لا تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع الكواشف الأخرى. يمكن إذا ELISA مجموعات لا تأتي مع لوحات ما قبل المغلفة، 96-وحات جيدة جيدا أو نصف لوحات 384 جيد أن تستخدم لتقليل استخدام مزيد من عينات / الكواشف.
يتم قياس الحادة الطعم ضد المضيف المرض (GVHD)، وهو السبب الرئيسي للوفيات غير الانتكاس (إدارة الموارد الطبيعية) بعد خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT)، عن طريق الخلل في أجهزة الجسم ثلاثة: الجلد والكبد والجهاز الهضمي (GI) المسالك 4. GVHD الحادة يحدث عادة بين اثنين وثمانية أسابيع بعد زرع لكن قد تحدث في وقت لاحق، وغالبا ما يكون تمييزه سريريا من مضاعفات ما بعد HSCT أخرى مثل نظام تكييف سمية، والعدوى أو آثار جانبية للدواء. من خلال استخدام استراتيجيات البروتين والتحقق من صحة عالية الإنتاجية باستخدام ELISA متتابعة، وقد حددت لدينا 6 البروتينات التي تركيزات مرتفعة في بداية المظاهر السريرية للGVHD. يمكن تشخيص GVHD IL-2Rα، TNFR1، HGF و8-IL، عند دمجها في لوحة العلامات البيولوجية 4-في ظهور الأعراض السريرية ويمكن التنبؤ بعد HSCT بقاء بمعزل عن شدة GVHD 1. Elafin، العلامات البيولوجية لGVHD من SKفي، يمكن التمييز بين الطفح الجلدي والطفح GVHD لأسباب أخرى مثل الانفجارات المخدرات والبقاء على قيد الحياة يمكن أن يتنبأ زرع 2. حددنا مؤخرا REG3α والعلامات البيولوجية لGVHD من الجهاز الهضمي السفلي، الجهاز المستهدف الأكثر ارتباطا إدارة الموارد الطبيعية. يمكن تركيز البلازما REG3α تحديد موثوق GVHD كسبب لمرحلة ما بعد HSCT الإسهال وربط لشدة نسيجية من GVHD على الخزعات المعوية التشخيص. يمكن تركيزات REG3α في بداية GVHD GI التنبؤ أيضا الاستجابة للعلاج GVHD وإدارة الموارد الطبيعية 3. حاليا إدماج هذه المؤشرات الحيوية في التحقق من صحة GVHD الرعاية السريرية يجري التحقيق في التجارب السريرية.
وأجريت هذه التجارب على البلازما مأخوذة الصغيرة التي تم جمعها من المرضى الذين يتلقون HSCT بين عامي 2000 و 2010 في وقت ظهور GVHD التي لا يمكن تعويضها والكمية محدودة. ونظرا لطبيعة هذه العينات الثمينة من، قمنا بتطوير الحدهود لقياس تركيزات بروتين البلازما متعددة بطريقة فعالة للقضاء على استنساخه الزائدة تجميد ذوبان الجليد دورات، واستخدام الوقت تحسن البلازما. ويمكن تطبيق هذه التقنية على أداء ELISAs لبروتينات متعددة / السيتوكينات الفائدة على نفس العينة (ق) قدمت عينات لا تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع الكواشف الأخرى. يمكن إذا ELISA مجموعات لا تأتي مع لوحات ما قبل المغلفة، 96-وحات جيدة جيدا أو نصف لوحات 384 جيد أن تستخدم لتقليل استخدام مزيد من عينات / الكواشف. هذا المخطوط يركز على الجوانب التكنولوجية لقياس المؤشرات الحيوية GVHD.
طريقة ELISA متتابعة المقدمة هنا يسمح لقياس بروتينات البلازما متعددة على وحدات تخزين صغيرة من البلازما التي قد يكون من الصعب الحصول على و / أو التي لا يمكن تعويضها مثل عينات من البشر يعانون من أمراض نادرة أو عينات تم الحصول عليها من البلازما الفئران 9،10. يتم تنفيذ عادة ELISAs متتابعة في ترتيب زيادة عامل تخفيف البلازما، مع ELISAs تتطلب البلازما المخفف ≥. 1:10 عادة لا تحتاج لاستخلاص، على الرغم من ويمكن أن يتم هذا إذا رغبت في ذلك ويقتصر القدرة على أداء ELISA ELISA متتابعة من قبل مجموعات / البروتوكولات التي يختلط البلازما مع الكواشف الأخرى أو التي تتطلب مخازن مختلفة لتخفيف البلازما، وهذا ما يحول دون ablility لعينة إعادة استخدام بسبب مخاوف من أن غير متوافق سوف العازلة / كاشف تتداخل مع أداء اختبار معين. مع التخطيط الدقيق، قد يتم تنفيذ 10 أو أكثر ELISAs على عينة البلازما نفسه.
قد الأنف والحنجرة "> مختبرات فردية تحتاج إلى ضبط التخفيفات البلازما من أجل الحصول على النتائج على أساس تفسير تركيزات البلازما من البروتين المتوقعة من الاهتمام في عينات من اختبار المواضيع. الاختلافات في المعدات المختبرية قد يؤدي إلى الحاجة إلى تحسين الحضانة والتنمية اللونية مرات، وعدد من يغسل و / أو غسل نقع مرة من أجل تحسين أي ELISA معين.لزيادة القدرة الإنتاجية العالية والدقة وإجراء تحليلات بطريقة فعالة من حيث التكلفة، ويوصى باستخدام منصة تداول السائل الروبوتية قادرة على تحليل لوحات جيدا على 384 وغسالة لوحة الآلي مع وحدة التراص. يمكن هذا الجهاز زيادة دقة ودقة التحليل التي يقوم بها العديد من المستخدمين، وتساعد على توفير اتساق التحليل للحد من بين وداخل مقايسة الاختلاف.
كنا ELISA متتابعة على منصات متعددة متاحة لسببين: 1) معظميمكن للأزواج الأضداد البروتينات الرواية لا يكون من السهل على مترافق الخرز أو غيرها من المواد وكذلك مضيعة للوقت ومكلفة، 2) ELISA الفردية المقايسات أكثر دقة من ميكروأري متعددة أو الخرز، والثانوية لعدم وجود تفاعل المتبادل 11. إذا ثبت وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتنفيذ المضاعفة، وحبة القائم على ميكروأرس، قد تكون قادرة على استبدال عملية ELISA متتابعة، ولكن قد تكون محدودة بسبب القدرة على الأجسام المضادة المتقارن لالخرز و / أو من قبل عدد من البروتينات المطلوبة لتكون تحليلها.
The authors have nothing to disclose.
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح RC1-HL-101102، P01-CA039542، T32-HL007622، ومؤسسة هارتويل، ومؤسسة دوريس ديوك الخيرية. الدكتور Paczesny هو محقق للصندوق هارتويل اريك والبحوث ايمي Manasevit برنامج Strelzer.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |