Birden fazla aday biyobelirteçlerin Yüksek throughput doğrulama donma / çözülme çevrimleri en aza indirmek ve değerli plazma numunesi kullanmak için sıralı ELISA ile yapılabilir. Burada, sıralı altı farklı valide plazma biyobelirteçleri için ELISA'lar gerçekleştirmek için nasıl göstermek<sup> 1-3</sup> Graft-versus-host hastalığı (GVHH)<sup> 4</sup> Aynı plazma örneği üzerinde.
Tarafsız keşif proteomik stratejiler klinik ortamda tanısal ve prognostik test artırabilir ve kılavuz terapötik girişimlere yardımcı olabilecek yeni biyomarkerler sayıda tanımlamak için bir potansiyele sahiptir. Aday proteinleri çok sayıda tespit edildiğinde, bu tür akut başlangıçlı itibariyle sonlu hacim, olay odaklı ve yeri doldurulamaz olan hasta plazma numuneleri, bir zamanında ve verimli bir şekilde aday biyobelirteçlerin doğrulamak zor olabilir graft-versus- host hastalığı (GVHH), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) bir potansiyel olarak yaşamı tehdit eden bir komplikasyondur.
En aza indirmek için ardışık bir şekilde IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, 3 ve REG3α (aynı zamanda PAP1 olarak da bilinir): Burada altı doğrulanmış GVHD proteinler için ticari olarak mevcut ELISA'lar gerçekleştirme işlemini tarif donma-çözülme döngüleri, Plazma zaman ve plazma kullanımı çözülmüş. Optimum sıralı ELISA performansı kolaylaştırmak için küçük ayarlamalar ile üretici ELISA kitleri ve protokollerini kullanarak Laboratuvarımızda kurulmuş olarak örnek seyreltme faktörü ile belirlenir, bu işlem için biz sırayla ELISA'lar gerçekleştirin. Çıkan plazma biyolojik konsantrasyonları sonra derlenen ve bir hasta kohort içinde önemli bulgular için analiz edilebilir. Bu biyobelirteçlerin sadece araştırma amaçlı anda olsa da, klinik bakım onların içine eklenmesi halen klinik çalışmalarda araştırılmaktadır.
Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA'da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir.
Akut graft-versus-host hastalığı (GVHD), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) sonrasında non-relaps mortalite (UYM) önde gelen nedeni, üç organ sistemi disfonksiyonu ile ölçülür: deri, karaciğer ve gastrointestinal (Gİ) yolu 4. Akut GVHH genellikle iki ila sekiz hafta nakli sonra oluşur ancak daha sonra ortaya çıkabilir ve genellikle rejimin toksisite, enfeksiyon veya ilaç yan etkileri gibi diğer post-HKHT komplikasyonlar klinik olarak ayirt olduğunu. Sıralı ELISA kullanılarak proteomik stratejileri ve high-throughput doğrulama kullanımı sayesinde, kimin konsantrasyonları GVHH klinik belirtilerin başlangıcında yükselir 6 proteinler belirledik. 4 biyomarker paneli birleştirilir IL-2Rα, TNFR1, HGF ve IL-8, klinik semptomların başlangıcında GVHD teşhis edebilir ve bağımsız GVHH şiddeti 1 post-HKHT sağkalım tahmin edebilirsiniz. Elafin, sk GVHH için bir biyomarker, bu tür ilaç döküntüleri gibi diğer nedenler GVHH döküntü ve döküntü ayırt edebilir ve nakli sağkalım 2. tahmin edebilirsiniz. Biz son zamanlarda alt gastrointestinal GVHH bir biyomarker olarak REG3α belirledik, hedef organ en UYM ile ilişkilidir. Plazma REG3α konsantrasyonu güvenilir post-HKHT ishal nedeni olarak GVHD tespit ve teşhis barsak biyopsilerde GVHH histolojik şiddeti ilişkili olabilir. GI GVHH başlangıcında REG3α konsantrasyonları da GVHH tedavisi ve UYM 3 yanıt tahmin edebilirsiniz. Klinik bakım içine bu valide GVHH biyobelirteçlerin birleşme anda klinik çalışmalarda araştırılmaktadır.
Bu deneyler yeri doldurulamaz ve sınırlı büyüklüktedir GVHH başlama zamanında 2000 ve 2010 yılları arasında HKHT alan hastalardan toplanan küçük plazma alikotları yapıldı. Bu örneklerin değerli doğası gereği, biz bir araya geldi geliştirdikaşırı donma-çözülme döngüleri, çözünme zamanı ve plazma kullanımını ortadan kaldırmak için etkili, tekrarlanabilir bir şekilde birden fazla plazma protein konsantrasyonu ölçüm hod. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA'da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir. Bu yazıda GVHH biyolojik ölçüm teknolojik yönleri üzerinde duruluyor.
Burada sunulan sıralı ELISA yöntemi örneğin fare 9,10 elde nadir hastalıklar veya plazma örnekleri ile insan denekler örnekleri de yeri doldurulamaz edinme ve / veya zor olabilir plazma küçük hacimlerde birden fazla plazma proteinlerinin ölçümü sağlar. Sıralı ELISA'lar genellikle gerektiren ELISA'lar ile artan plazma seyreltme faktörü amacıyla yapılan plazma seyreltilmiş ≥ genellikle istenirse bu yapılabilir, ancak iadesi olmaya gerek yok 01:10. Vardır Ardışık ELISA gerçekleştirmek için yetenek plazma diğer reaktifler ile karıştırıldığında ya da farklı olan seyreltme tampon plazma için gerekli olan ELISA kitleri / protokoller ile sınırlıdır, bu yeniden kullanımı bir örnek dolayı bir uyumsuz kaygılar ablility engellemektedir tampon / reaktif Belirli bir testin performansını etkileyecektir. Dikkatli planlama ile, 10 ya da daha fazla aynı ELISA'lar plazma örneği üzerinde gerçekleştirilebilir.
ent "> Bireysel laboratuarlarda denek gelen örneklerde ilgi protein beklenen plazma konsantrasyonlarına dayalı yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için plazma dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir. laboratuar ekipmanları farklılıklar inkübasyon ve kolorimetrik geliştirme optimize etmek için ihtiyaç neden olabilir kez, yıkar sayısı ve / veya yıkama herhangi bir ELISA optimize etmek amacıyla kez ıslatın.High-throughput kapasitesi ve doğruluğu artırmak için ve maliyet-etkin bir şekilde analizler yaparak, 384 iyi plakaları üzerinde analiz ve istifleme ünitesi ile otomatik plaka yıkayıcı yeteneğine sahip bir robot sıvı taşıma platform kullanımı tavsiye edilir. Bu cihaz birden fazla kullanıcı tarafından yapılan analizlerin doğruluğunu ve hassasiyetini artırmak, ve inter-ve intra-analiz varyasyonu azaltmak için analiz tutarlılığı sağlamaya yardımcı olabilir.
) 1 çoğu: Biz iki nedenden dolayı mevcut multipleks platformlar üzerinde sıralı ELISAroman proteinler için antikor çiftleri kolayca boncuk veya diğer malzemelerin üzerine konjuge yanı sıra, zaman alıcı ve pahalı olamaz; 2) Bireysel ELISA deneyleri çapraz reaktivite 11 yokluğu sekonder multipleks mikroarray veya boncuklar, daha kesindir. Güvenilir bir yöntem çoğaltılmış, boncuk esaslı mikrodizileri gerçekleştirmek için kurulmuştur, bu ardışık ELISA işlemi yerine mümkün olabilir, fakat boncuklar ve / eşlenik antikorların yeteneğini ya da olması istenen proteinlerin sayısı ile sınırlıdır edilebilir analiz.
The authors have nothing to disclose.
NIH hibe RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Hartwell Vakfı ve Doris Duke Vakfı tarafından desteklenir. Dr Paczesny Eric Hartwell fonu ve Amy Strelzer Manasevit Araştırma Programı bir dedektiftir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |