High throughput validatie van meerdere kandidaat biomarkers kan worden uitgevoerd door opeenvolgende ELISA om vries / ontdooi cycli te minimaliseren en het gebruik van kostbare plasmamonsters. Hier laten we zien hoe u achtereenvolgens ELISA's voor zes verschillende gevalideerde plasma biomarkers te voeren<sup> 1 tot 3</sup> Of graft-versus-host disease (GVHD)<sup> 4</sup> Op hetzelfde plasma monster.
Onpartijdige ontdekking proteomics strategieën de mogelijkheid om grote aantallen van nieuwe biomarkers die diagnostische en prognostische testen kan verbeteren in een klinische setting en kan helpen sturen therapeutische interventies. Wanneer grote aantallen kandidaat-eiwitten geïdentificeerd, kan het moeilijk zijn om kandidaat biomarkers in een tijdige en efficiënte wijze valideren van patiënt plasmamonsters die gebeurtenisgestuurde van eindige volume en onvervangbaar, zoals aan het begin van acute graft-versus- host disease (GVHD), een potentieel levensbedreigende complicatie van allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT).
Hier beschrijven we het proces van het uitvoeren handel verkrijgbare ELISA gevalideerd GVHD zes eiwitten: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 en REG3α 3 (ook bekend als PAP1) in een sequentiële wijze te minimaliseren vries-dooi cycli, Ontdooid plasma-tijd-en plasma gebruik. Voor deze procedure voeren wij de ELISA's in de juiste volgorde, zoals bepaald door monster verdunningsfactor zoals bepaald in ons laboratorium met behulp van fabrikant ELISA-kits en protocollen met kleine aanpassingen om een optimale sequentiële ELISA te vergemakkelijken. De resulterende plasma biomarker concentraties kan dan worden samengesteld en geanalyseerd op significante bevindingen binnen een patiëntenpopulatie. Hoewel deze biomarkers zijn op dit moment alleen voor onderzoeksdoeleinden, wordt de opname daarvan in de klinische zorg op dit moment onderzocht in klinische studies.
Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia.
Acute graft-versus-host disease (GVHD), een belangrijke oorzaak van niet-terugval sterfte (NRM) na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT), wordt gemeten door disfunctie in drie orgaansystemen: de huid, lever en gastro-intestinale (GI) darmkanaal 4. Acute GVHD gebeurt meestal twee tot acht weken na transplantatie maar kan later optreden en vaak klinisch onderscheiden van andere post-HSCT complicaties zoals conditionering toxiciteit, infectie of bijwerkingen van medicijnen. Door het gebruik van proteomische strategieën en high-throughput validatie sequentiële ELISA hebben we vastgesteld 6 eiwitten waarvan concentraties worden verhoogd bij het begin van klinische manifestaties van GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF en IL-8 in combinatie in een 4-biomarker panel kan diagnosticeren GVHD bij het begin van klinische symptomen en kan na HSCT overleving voorspellen onafhankelijk van GVHD ernst 1. Elafin, een biomarker voor GVHD van de skin, onderscheid kan maken tussen GVHD huiduitslag en huiduitslag door andere oorzaken, zoals drug uitbarstingen en kan transplantatie overleving 2 te voorspellen. We hebben onlangs geïdentificeerd REG3α als biomarker van GVHD van de lagere maag-darmkanaal, het doelorgaan het meest geassocieerd met NRM. Plasma REG3α concentratie op betrouwbare wijze kan identificeren GVHD als de oorzaak voor post-HSCT diarree en correleren met histologische ernst van GVHD op diagnostische darm biopten. REG3α concentraties op GI GVHD begin kan ook voorspellen respons op GVHD therapie en NRM 3. De incorporatie van deze gevalideerde GVHD biomarkers in de klinische zorg wordt momenteel onderzocht in klinische studies.
Deze experimenten werden uitgevoerd op kleine plasma monsters verzameld van patiënten die HSCT tussen 2000 en 2010 op het moment van GVHD optreden die onvervangbaar en beperkte hoeveelheid. Door de kostbare aard van deze monsters hebben we een gehaaldhod meten van meerdere plasma eiwitconcentraties op een efficiënte en reproduceerbare wijze overtollige vries-dooi cycli, ontdooien tijd en plasma gebruik elimineren. Deze techniek kan worden toegepast op ELISA voor meerdere eiwitten / cytokines plaats uitvoeren op hetzelfde monster (s) die de monsters niet te worden gemengd met andere reagentia. Als ELISA kits komen niet met pre-beklede platen met 96 putjes half putjes of 384 putjes gebruikt kan worden ter minimalisering gebruik van monsters / reagentia. Dit manuscript is gericht op de technologische aspecten van het meten van GVHD biomarkers.
De sequentiële ELISA methode hier gepresenteerde maakt meting van meerdere plasmaeiwitten op kleine hoeveelheden plasma die moeilijk te verkrijgen en / of onvervangbare zoals monsters uit proefpersonen met zeldzame ziekten of plasmamonsters verkregen van muizen 9,10. De sequentiële ELISA wordt typisch uitgevoerd in de volgorde van toenemende plasma verdunningsfactor met ELISA waarbij plasma verdund ≥ 1:10 doorgaans niet om worden teruggewonnen, hoewel dit kan indien gewenst. Het vermogen om sequentiële ELISA voeren wordt beperkt door ELISA kits / protocollen waarin het plasma wordt gemengd met andere reagentia of waarvoor verschillende verdunning buffers nodig zijn voor het plasma, deze sluit de ablility opnieuw een steekproef vanwege zorgen dat een incompatibele buffer / reagens interfereren met de uitvoering van een bepaalde test. Met zorgvuldige planning kan 10 of meer ELISA uitgevoerd op dezelfde plasmamonster.
ent "> elk laboratorium wellicht plasmaverdunningen passen om interpreteerbare resultaten gebaseerd op de verwachte plasmaconcentratie van het eiwit van interesse in de monsters van de proefpersonen hebben. Verschillen in laboratoriumapparatuur kan resulteren in de noodzaak om incubatie en colorimetrische ontwikkeling te verbeteren tijden, het aantal wassingen en / of was uitzettijden om een bepaalde ELISA optimaliseren.Met hoge doorvoercapaciteit en nauwkeurigheid vergroten en analyses in een kosteneffectieve wijze, het gebruik van een robot vloeistofverwerking platform kan analyse van platen met 384 putjes en een automatische plaatwasser met stapelblok aanbevolen. Deze apparatuur kan de nauwkeurigheid en juistheid van de analyse uitgevoerd door meerdere gebruikers, en hulp te bieden consistentie van analyse tot inter-en intra-assay variatie te verminderen.
We gebruikten sequentiële ELISA dan beschikbaar multiplex platforms om twee redenen: 1) Het merendeel van deantilichaam paren voor nieuwe eiwitten kunnen niet gemakkelijk worden geconjugeerd aan kralen of ander materiaal, alsmede tijdrovend en duur; 2) individuele ELISA-assays zijn nauwkeuriger dan multiplex microarray of kralen, secundair aan een gebrek aan cross-reactiviteit 11. Indien er een betrouwbare methode aangetoond gemultiplext, bead-based microarrays vervullen, kan hij in staat om de sequentiële ELISA proces te vervangen, maar zijn beperkt door het vermogen om de antilichamen te conjugeren kralen en / of door het aantal gewenste eiwitten te geanalyseerd.
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door NIH subsidie RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, de Hartwell Foundation, en de Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny is een onderzoeker van de Eric Hartwell fonds en de Amy Strelzer Manasevit Research Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |