High throughput validering af flere kandidat biomarkører kan udføres ved sekventiel ELISA for at minimere fryse / optøningscykler og anvendelse af kostbare plasmaprøver. Her vil vi vise, hvordan man sekventielt udføre ELISA'er for seks forskellige validerede plasma biomarkører<sup> 1-3</sup> Af graft-versus-vært sygdom (GVHD)<sup> 4</sup> På samme plasmaprøve.
Unbiased discovery proteomics strategier har potentiale til at identificere et stort antal hidtil ukendte biomarkører, der kan forbedre diagnostisk og prognostisk test i et klinisk miljø, og kan vejlede terapeutiske indgreb. Når et stort antal kandidat proteiner er identificeret, kan det være vanskeligt at validere kandidat biomarkører i en rettidig og effektiv måde fra patient plasmaprøver, der er event-driven, af finite volumen og uerstattelige, såsom ved begyndelsen af akut graft-versus- værtssygdom (GVHD), en potentielt livstruende komplikation ved allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT).
Her beskrives processen med at udføre kommercielt tilgængelige ELISA'er for seks validerede GVHD proteiner: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 og REG3α 3 (også kendt som PAP1) i en sekventiel måde for at minimere fryse-tø cykler, Optøet plasma tid og plasma brug. For denne procedure, vi udfører ELISA-test i rækkefølge som bestemt ved prøve fortyndingsfaktor som fastlagt i vores laboratorium ved brug af producenten ELISA kits og protokoller med mindre justeringer for at lette optimal sekventiel ELISA ydeevne. De resulterende plasma biomarkør koncentrationer kan derefter indsamles og analyseres for væsentlige resultater inden for en patient kohorte. Mens disse biomarkører er i øjeblikket kun beregnet til research, er deres integration i klinisk pleje i øjeblikket ved at blive undersøgt i kliniske forsøg.
Denne teknik kan anvendes til at udføre ELISA'er for multiple proteiner / cytokiner af interesse på den samme prøve (r), forudsat prøverne ikke behøver at blive blandet med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med præ-coatede plader, 96 brønde halv-brøndsplader eller 384-brønds plader kan anvendes for yderligere at minimere brug af prøver / reagenser.
Akut graft-versus-vært sygdom (GVHD), en førende årsag til ikke-tilbagefald dødelighed (NRM) efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT), måles ved dysfunktion i tre organsystemer: hud, lever og gastrointestinal (GI) tarmkanalen 4. Akut GVHD forekommer typisk mellem to og otte uger efter transplantation men kan forekomme senere, og er ofte klinisk ikke kan skelnes fra andre post-HSCT komplikationer såsom conditioning regimen toksicitet, infektion eller medicin bivirkninger. Ved anvendelse af proteom strategier og high-throughput validering med sekventiel ELISA har vi identificeret seks proteiner, hvis koncentrationer forhøjet ved de kliniske manifestationer af GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF og IL-8, når de kombineres i en 4-biomarkør panel kan diagnosticere GVHD ved indtræden af kliniske symptomer og kan forudsige post-HSCT overlevelse uafhængigt af GVHD sværhedsgrad 1. Elafin, en biomarkør for GVHD af ski, kan skelne mellem GVHD udslæt og udslæt af andre årsager, såsom narkotika udbrud og kan forudsige transplantation overlevelse 2. Vi har for nylig identificeret REG3α som biomarkør for GVHD af den nedre mavetarmkanal, målorganet mest forbundet med NRM. Plasma REG3α koncentration pålideligt kan identificere GVHD som årsag til post-HSCT diarré og korrelere til histologisk sværhedsgraden af GVHD på diagnostiske tarmbiopsier. REG3α koncentrationer ved GI GVHD indtræden kan også forudsige reaktion på GVHD terapi og NRM 3. Indarbejdelsen af disse validerede GVHD biomarkører i klinisk pleje i øjeblikket ved at blive undersøgt i kliniske forsøg.
Disse forsøg blev udført på små plasma prøver indsamlet fra patienter, der fik HSCT mellem 2000 og 2010 på tidspunktet for GVHD debut som er uerstattelige og af begrænset mængde. På grund af den værdifulde beskaffenhed af disse prøver, har vi udviklet en method at måle multiple plasma proteinkoncentrationer på en effektiv og reproducerbar måde at fjerne overskydende fryse-tø cykler, tø tid og plasma brug. Denne teknik kan anvendes til at udføre ELISA'er for multiple proteiner / cytokiner af interesse på den samme prøve (r), forudsat prøverne ikke behøver at blive blandet med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med præ-coatede plader, 96 brønde halv-brøndsplader eller 384-brønds plader kan anvendes for yderligere at minimere brug af prøver / reagenser. Dette håndskrift fokuserer på de teknologiske aspekter af måling af GVHD biomarkører.
Den sekventielle ELISA-metode præsenteres her muliggør måling af flere plasmaproteiner på små volumener af plasma, som kan være vanskeligt at opnå og / eller uerstattelige, såsom prøver fra humane individer med sjældne sygdomme eller plasmaprøver opnået fra mus 9,10. De sekventielle ELISA'er udføres typisk i rækkefølge efter stigende plasma fortyndingsfaktor, med ELISA'er kræver plasma fortyndet ≥ 1:10 typisk ikke behøver at blive regenereret, selv om dette kan gøres om ønsket. Evnen til at udføre sekventiel ELISA er begrænset af ELISA kits / protokoller, hvori plasmaet blandes med andre reagenser eller som forskellige fortyndings buffere er nødvendige for plasma, hvilket udelukker ablility at genbruge en prøve på grund af frygt for, at en inkompatible buffer / reagens vil forstyrre udførelsen af en bestemt test. Med omhyggelig planlægning, kan 10 eller flere ELISA'er skal udføres på samme plasmaprøve.
ENT "> Individuelle laboratorier kan være nødvendigt at justere plasma fortyndinger for at få fortolkelige resultater baseret på de forventede plasmakoncentrationer af proteinet af interesse i prøverne fra forsøgspersonerne. Forskelle i laboratorieudstyr kan resultere i et behov for at optimere inkubation og kolorimetriske udvikling tider, antal vaske-og / eller vaske sættetider for at optimere en given ELISA.At øge high-throughput kapacitet og nøjagtigheden og at udføre analyser på en omkostningseffektiv måde, er anvendelsen af en robot væskehåndtering platform stand til analyse af 384-brønds plader og en automatisk pladevasker med stableenhed anbefales. Dette udstyr kan øge nøjagtigheden og præcisionen af analyse udført af flere brugere, og bidrage til at give sammenhæng analyse for at reducere inter-og intra-assay variation.
Vi brugte sekventiel ELISA løbet tilgængelige multipleks platforme af to grunde: 1) De fleste af deantistof-par for hidtil ukendte proteiner kan ikke let konjugeres til kugler eller andet materiale samt tidskrævende og dyre, 2) individuelle ELISA-assays er mere præcise end multiplex microarray eller perler, sekundært til et fravær af krydsreaktivitet 11. Hvis en pålidelig metode er etableret til at udføre multipleksede, kugle-baserede microarrays, kan det være i stand til at erstatte den sekventielle ELISA-processen, men kan være begrænset af evnen til at konjugere antistofferne til perler og / eller antallet af proteiner, der ønskes analyseres.
The authors have nothing to disclose.
Støttet af NIH tilskud RC1-HL-101.102, P01-CA039542, T32-HL007622, den Hartwell Fonden samt Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny er et investigator i Eric Hartwell fond og Amy Strelzer Manasevit Research Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |