Validation à haut débit de biomarqueurs multiples peut être effectuée par ELISA séquentielle afin de minimiser les cycles gel / dégel et à utiliser des échantillons de plasma précieux. Ici, nous montrons comment réaliser de manière séquentielle ELISA pour six différents biomarqueurs plasmatiques validées<sup> 03.01</sup> La réaction du greffon contre l'hôte (GVHD)<sup> 4</sup> Sur le même échantillon de plasma.
Impartiales protéomique de découverte stratégies ont le potentiel d'identifier un grand nombre de nouveaux biomarqueurs qui peuvent améliorer les tests de diagnostic et de pronostic dans un contexte clinique et peut aider à guider les interventions thérapeutiques. Lorsqu'un grand nombre de protéines candidates sont identifiées, il peut être difficile de valider des biomarqueurs candidats en temps opportun et efficace des échantillons plasmatiques de patients qui sont event-driven, de volume fini et irremplaçable, comme au début de la réaction aiguë du greffon contre l' greffon contre l'hôte (GVHD), une complication potentiellement mortelle de l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT).
Ici, nous décrivons le processus d'exécution ELISA disponibles dans le commerce pour six protéines validées GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, élafine 2 et REG3α 3 (également connu sous le nom PAP1) de manière séquentielle afin de minimiser cycles gel-dégel, Décongelés temps de plasma et de l'utilisation du plasma. Pour cette procédure nous effectuons les tests ELISA dans un ordre séquentiel tel que déterminé par le facteur de dilution de l'échantillon comme établi dans notre laboratoire en utilisant fabricant kits ELISA et protocoles avec des ajustements mineurs pour faciliter une performance optimale séquentielle ELISA. Les concentrations plasmatiques des marqueurs biologiques résultant peut ensuite être compilé et analysé des résultats significatifs au sein d'une cohorte de patients. Bien que ces biomarqueurs sont actuellement à des fins de recherche uniquement, leur intégration dans les soins cliniques est actuellement à l'étude dans des essais cliniques.
Cette technique peut être appliquée pour effectuer les tests ELISA pour de multiples protéines / cytokines d'intérêt sur le même échantillon (s) à condition que les échantillons n'ont pas besoin d'être mélangé avec d'autres réactifs. Si kits ELISA ne viennent pas avec des plaques pré-enduites, de 96 puits demi-puits des plaques ou des plaques de 384 puits peuvent être utilisés pour réduire davantage l'utilisation d'échantillons / réactifs.
Aiguë du greffon contre l'hôte (GVHD), une des principales causes de la non-récidive de mortalité (NRM) après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT), est mesurée par un dysfonctionnement dans trois systèmes d'organes: la peau, le foie et gastro-intestinal (GI) voies 4. GVHD aiguë survient généralement entre deux et huit semaines après la greffe, mais peut survenir plus tard, et il est souvent impossible à distinguer cliniquement d'autres complications post-HSCT tels que la toxicité du conditionnement, une infection ou des effets secondaires des médicaments. Grâce à l'utilisation de stratégies protéomiques à haut débit et de validation en utilisant séquentielle ELISA, nous avons identifié 6 protéines dont les concentrations sont élevées au début des manifestations cliniques de GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF et de l'IL-8, lorsqu'il est combiné à un panneau de 4-biomarqueur peut diagnostiquer GVHD à l'apparition des symptômes cliniques et peut prédire la survie post-greffe de CSH indépendamment de la gravité de la GVHD 1. Élafine, un biomarqueur de GVHD de la sken, peut faire la différence entre une éruption GVHD et une éruption cutanée à d'autres causes telles que les éruptions de drogue et peut prédire la survie de greffe 2. Nous avons récemment identifié REG3α en tant que biomarqueur de la GVHD du tractus gastro-intestinal, l'organe cible le plus associé à la GRN. Plasma REG3α concentration peut identifier de manière fiable GVHD comme la cause de la diarrhée post-greffe de CSH et en corrélation avec la sévérité de la GVHD histologique sur biopsies intestinales de diagnostic. Concentrations REG3α à GI GVH apparition peut également prédire la réponse au traitement et gestion des ressources naturelles GVHD 3. L'incorporation de ces biomarqueurs validés GVHD dans les soins cliniques est actuellement à l'étude dans des essais cliniques.
Ces expériences ont été réalisées sur des aliquotes de plasma petites recueillies auprès des patients recevant HSCT entre 2000 et 2010 au moment de l'apparition de GVHD qui sont irremplaçables et de quantité limitée. En raison de la nature précieuse de ces échantillons, nous avons développé un a rencontréhod de mesurer les concentrations de plusieurs protéines plasmatiques dans une manière efficace et reproductible pour éliminer l'excès de gel-dégel, le temps de décongélation et l'utilisation de plasma. Cette technique peut être appliquée pour effectuer les tests ELISA pour de multiples protéines / cytokines d'intérêt sur le même échantillon (s) à condition que les échantillons n'ont pas besoin d'être mélangé avec d'autres réactifs. Si kits ELISA ne viennent pas avec des plaques pré-enduites, de 96 puits demi-puits des plaques ou des plaques de 384 puits peuvent être utilisés pour réduire davantage l'utilisation d'échantillons / réactifs. Ce manuscrit se concentre sur les aspects technologiques de la mesure de biomarqueurs GVHD.
La méthode ELISA séquentielle présentée ici permet de mesurer des protéines plasmatiques multiples sur de petits volumes de plasma qui peuvent être difficiles à obtenir et / ou irremplaçables tels que des échantillons provenant de sujets humains atteints de maladies rares ou des échantillons de plasma provenant de souris 9,10. Les tests ELISA séquentiels sont généralement effectuées dans l'ordre d'un facteur de dilution de plasma augmente, avec les tests ELISA nécessitent plasma dilué ≥ 1:10 généralement pas besoin d'être remis en état, même si cela peut être fait si désiré. La possibilité d'effectuer séquentielle ELISA est limitée par des kits ELISA / protocoles dans lequel le plasma est mélangé avec d'autres réactifs ou pour lesquels tampons de dilution différentes sont nécessaires pour le plasma, ce qui exclut la ablility de réutiliser un échantillon en raison de préoccupations qu'un incompatibles tampon / réactif va interférer avec la performance d'un test particulier. Avec une planification soigneuse, plus de 10 tests ELISA peuvent être effectuées sur le même échantillon de plasma.
rents "> Les laboratoires peuvent avoir besoin d'ajuster dilutions de plasma afin d'avoir des résultats interprétables basés sur les concentrations plasmatiques attendues de la protéine d'intérêt dans les échantillons provenant de sujets testés. différences dans l'équipement de laboratoire peut entraîner la nécessité d'optimiser l'incubation et le développement colorimétrique fois, le nombre de lavages et / ou laver temps d'immersion afin d'optimiser toute donnée ELISA.Pour augmenter la capacité de haut débit et de précision et d'effectuer des analyses d'une manière rentable, l'utilisation d'une plate-forme de manipulation des liquides robotique capable d'analyse sur plaques de 384 puits et un laveur de plaque automatique avec unité d'empilage sont recommandés. Cet équipement peut augmenter l'exactitude et la précision des analyses effectuées par plusieurs utilisateurs, et aider à assurer la cohérence de l'analyse de réduire inter-et intra-laboratoires.
Nous avons utilisé séquentielle ELISA sur des plateformes multiplex disponibles pour deux raisons: 1) La plupart despaires d'anticorps pour de nouvelles protéines ne peuvent pas facilement être conjugués sur des billes ou tout autre matériel ainsi que le temps et coûteuse; 2) individuels tests ELISA sont plus précis que les puces à ADN multiplex ou perles, secondaire à une absence de réactivité croisée 11. Si une méthode fiable est établie pour effectuer multiplexés, perles à base de puces à ADN, il peut être en mesure de remplacer le processus séquentiel ELISA, mais peut être limité par la capacité de conjuguer les anticorps à des billes et / ou par le nombre de protéines, désireux de se analysés.
The authors have nothing to disclose.
Soutenu par des subventions du NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, la Fondation Hartwell, et la Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny est un enquêteur du fonds Eric Hartwell et le Programme de recherche Amy Strelzer Manasevit.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |