Hoher Durchsatz Validierung mehrerer Biomarker-Kandidaten können durch sequentielle ELISA durchgeführt werden, um Einfrieren / Auftauen zu minimieren und die Nutzung von wertvollen Plasmaproben. Hier zeigen wir, wie man nacheinander durchführen ELISAs für sechs verschiedene validierte Plasma-Biomarker<sup> 1-3</sup> Of graft-versus-host disease (GVHD)<sup> 4</sup> Auf dem gleichen Plasmaprobe.
Unvoreingenommene Entdeckung Proteomics-Strategien haben das Potenzial, eine große Zahl von neuen Biomarkern, die diagnostische und prognostische Tests in einem klinischen Umfeld zu verbessern und kann möglicherweise Guide therapeutische Interventionen zu identifizieren. Wenn eine große Zahl von Kandidaten Proteine identifiziert werden, kann es schwierig sein, Biomarker-Kandidaten in einer zeitgerechten und effizienten Weise aus Patientenplasmaproben, die event-driven, der Finite-Volumen-und unersetzlich sind, wie zu Beginn der akuten validieren Graft-versus- host disease (GVHD), eine potenziell lebensbedrohliche Komplikation der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT).
Hier beschreiben wir die Verfahren zur Durchführung der im Handel erhältlichen ELISA-Tests für sechs validiert GVHD Proteine: IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, Elafin 2 und REG3α 3 (auch als PAP1 bekannt) in einer sequentiellen Weise zu minimieren Frost-Tau-Zyklen, Aufgetaut Plasma-Zeit und Plasma-Nutzung. Bei diesem Verfahren führen wir die ELISAs in Reihenfolge wie Probenverdünnungsfaktor bestimmt, wie in unserem Labor mit der Hersteller ELISA Kits und Protokolle mit geringfügigen Anpassungen, um eine optimale sequentielle ELISA Leistung erleichtert wird. Die resultierende Plasma-Biomarker-Konzentrationen können dann zusammengestellt und analysiert werden signifikante Ergebnisse innerhalb einer Patientengruppe. Während diese Biomarker derzeit nur für Forschungszwecke, wird ihre Einbeziehung in klinische Versorgung derzeit in klinischen Studien untersucht.
Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine / Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden.
Akute Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine führende Ursache von Nicht-Rückfall Mortalität (NRM) nach allogener Stammzelltransplantation (HSCT), wird durch eine Dysfunktion in drei Organsysteme gemessen: die Haut, Leber und Magen-Darm-(GI) Trakt 4. Akute GvHD tritt typischerweise zwischen zwei und acht Wochen nach der Transplantation kann aber später auftreten und ist oft klinisch nicht von anderen post-HSCT Komplikationen wie Konditionierung Toxizität, Infektionen oder Medikamente Nebenwirkungen. Durch den Einsatz von Proteom Strategien und Hochdurchsatz-Validierung mit sequentiellen ELISA haben wir 6 Proteine, deren Konzentrationen an dem Einsetzen der klinischen Manifestationen von GVHD erhöht identifiziert. IL-2Rα, TNFR1, HGF und IL-8, wenn sie in einem 4-Biomarker-Panel kombiniert werden zu Beginn der klinischen Symptome GVHD zu diagnostizieren und kann post-HSCT Überleben unabhängig von GVHD Schweregrad 1 vorherzusagen. Elafin, ein Biomarker für GVHD der skin, zwischen GVHD Ausschlag und Ausschlag von anderen Ursachen wie Arzneimittelexantheme diskriminieren und Transplantation das Überleben 2 vorherzusagen. Wir haben vor kurzem identifizierten REG3α als Biomarker von GVHD des unteren Gastrointestinaltrakt, das Zielorgan meisten mit NRM verbunden. Plasma REG3α Konzentration zuverlässig zu identifizieren GVHD als Ursache für post-HSCT Durchfall und korrelieren mit histologischen Schwere der GvHD auf diagnostische Darmbiopsien. REG3α Konzentrationen an GI GVHD Ausbruch kann auch vorhersagen, Reaktionsfähigkeit auf GVHD Therapie und NRM 3. Der Einbau dieser validierten GVHD Biomarker in der klinischen Versorgung wird derzeit in klinischen Studien untersucht.
Diese Experimente wurden auf kleinen Plasma-Aliquots von Patienten HSCT zwischen 2000 und 2010 bei der GVHD Auftreten, die unersetzlich und von begrenzter Menge sind gesammelt wurden. Aufgrund der wertvollen Natur dieser Proben haben wir eine met entwickelthod der Messung mehrere Plasma-Protein-Konzentrationen in einer effizienten, reproduzierbar, um überschüssige Gefrier-Auftau-Zyklen, Auftauzeit und Plasma Nutzung zu beseitigen. Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine / Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden. Dieses Manuskript konzentriert sich auf die technologischen Aspekte der Messung von GVHD Biomarkern.
Die sequentielle ELISA hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine Messung mehrerer Plasmaproteinen auf kleine Volumina von Plasma was schwierig sein kann zu erhalten, und / oder unersetzlichen wie Proben von Probanden mit der seltenen Erkrankungen oder Plasmaproben von Mäusen 9,10 erhalten. Die sequentiellen ELISAs werden typischerweise in der Reihenfolge der zunehmenden Plasmaverdünnung Faktor durchgeführt, mit ELISAs erfordern verdünnte Plasma ≥ 1:10 typischerweise nicht zu müssen aufgearbeitet werden, obwohl dies kann, falls gewünscht. Die Fähigkeit zur sequentiellen ELISA durchzuführen durch ELISA Kits / Protokolle in dem das Plasma mit anderen Reagenzien gemischt wird oder bei denen unterschiedliche Verdünnung Puffer für das Plasma benötigt begrenzt, dies schließt die ablility zur Wiederverwendung einer Probe aufgrund von Bedenken, dass eine inkompatible Puffer / Reagenz wird mit der Leistung eines bestimmten Tests stören. Bei sorgfältiger Planung kann 10 oder mehr ELISAs auf der gleichen Plasmaprobe durchgeführt werden.
ent "> Individuelle Labors müssen möglicherweise Plasmaverdünnungen anzupassen, um interpretierbare Ergebnisse auf erwartete Plasma-Konzentrationen des Proteins von Interesse in den Proben aus der Probanden basiert. Unterschiede in der Laborausrüstung kann in der Notwendigkeit führen, um die Inkubation und kolorimetrischen Entwicklung zu optimieren Zeiten, Anzahl der Wäschen und / oder waschen Haltezeiten um jede gegebene ELISA optimieren.Um hohe Durchsatzleistung und die Genauigkeit zu erhöhen und eine Untersuchung in kostengünstiger Weise durchzuführen, ist die Verwendung eines robotischen Liquid Handling Plattform fähig Analyse auf 384 Well Platten und einem automatisierten Tellerscheibe mit Stapeleinheit empfohlen. Dieses Gerät kann die Genauigkeit und Präzision der Analyse von mehreren Benutzern durchgeführt und helfen Konsistenz der Analyse inter-und intra-Assay-Variation zu reduzieren.
Wir verwendeten sequenziellen ELISA über verfügbare Multiplex-Plattformen für zwei Gründe: 1) Die meisten derAntikörper-Paare für neue Proteine können nicht leicht konjugiert werden auf Kügelchen oder einem anderen Material als auch zeitaufwendig und teuer, 2) einzelne ELISAs sind genauer als Multiplex-Mikroarray oder Kügelchen, sekundär zu einer Abwesenheit von Kreuzreaktivität 11. Wenn eine zuverlässige Methode hergestellt in gemultiplexte, wulst-basierten Microarrays durchzuführen, kann es in der Lage sein, um die sequentielle ELISA-Verfahren zu ersetzen, sondern kann durch die Möglichkeit, die Antikörper an Kügelchen und / oder konjugiert mit der Anzahl der gewünschten Proteine zu begrenzen analysiert.
The authors have nothing to disclose.
Unterstützt durch NIH Zuschüsse RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, der Hartwell-Stiftung, und der Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny ist ein Ermittler der Eric Hartwell Fonds und Amy Strelzer Manasevit Research Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |